结核菌素纯蛋白衍化物（TB-PPD）制造及检定规程
本品系用结核杆菌经液体表面培养、蒸汽杀菌过滤除去菌体，用沉淀分离、洗涤及再溶解的提纯方法制成的液体或冻干制品，含有从结核杆菌培养滤液中获得的活性物质，其主要成分是蛋白质，对已受结核菌感染或曾接受卡介苗免疫的机体，能引起特异的皮肤变态反应。用于检查结核杆菌的感染及观察免疫反应。
1 菌种
1.1 菌种由中国药品生物肉制品检定所分发或经同意。
1.2 制造TB-PPD用人型结核杆菌，菌号93009(H37Rv)。菌种应有完整的历史资料，经过全面检定，冻干保存。
1.3 应制备生产用菌种批，次级菌种批应控制在5代以内。
2 制造
全部生产过程，包括杀死分枝杆菌，应在完全隔离的区域内用专用设备进行。
2.1 制造用培养基
使用苏通马铃薯培养基，改良苏通综合培养基，或其他适宜培养基。培养基中应不含已知能对人或动物造成毒性和变态性反应的成分。
2.2 启开菌种(菌种批)反接种于苏通马铃薯培养基上。置37℃培养2～3周，可在苏通马铃薯培养基上再传一代或直接挑取苏通马铃薯管内生长良好的菌膜，移种于改良苏通综合培养基或其他适宜培养基的表面，置37℃静止培养1～2周，供大量接种用。
2.3 大量接种
挑取发育良好的菌膜移种于改良苏通综合培养基或其他适宜培养基的表面，置37℃静止培育8～10周。凡在培养期间或培养终止时，有菌膜下沉、发育异常或污染杂菌者，必须废弃。
2.4 杀菌
培养终止，将培养物加热，121℃30分钟进行杀菌处理。
2.5 除菌
杀菌后用滤器除去菌膜及菌体，收集滤液并取样做无菌试验，然后，加入0.3%苯酚或其他适宜的防腐剂。滤液保存在4～8℃，但要防止冻结。
2.6 提纯
用三氯乙酸和饱和硫酸铵法分别沉淀蛋白，加压过滤除去清液，并收集沉淀物于3μm孔径的滤膜上，然后用10%氯化钠液洗酸脱盐至中性为止，最后以磷酸盐缓冲液将沉淀物溶解，除菌过滤后即为原液。亦可采用其他适宜方法提纯。
2.7 分批
每次提纯的原液作为1亚批。最多将5个亚批混合组成为1批。
2.8 半成品检定
2.8.1 物理检查
原液应为深棕色的澄明液体，不应有沉淀物或其他杂质。
2.8.2 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
2.8.3 安全试验
用体重300～400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射原液1.0ml，观察6周，检查其症征或死亡。所有在试验后24小时内死亡的或表现出症征的动物应作镜检，然后将有关的组织镜检和培养，检查其有无分枝杆菌存在的证据。观察期中活存的动物也要以同样方法检查。
如果分析杆菌活菌培养试验阴性，在观察期中全部豚鼠健康存活，无一动物出现分枝杆菌的症征，则可判定浓缩原液通过试验。
如果未到观察期，任何动物死于非结核病因，本试验可复试一次。
2.8.4 致敏效应试验
实验组与对照组分别用体重300～400g未做过任何试验的健康豚鼠各3只，实验组每只豚鼠皮内注射0.1ml含500IUTB—PPD样品，共3次，每次间隔5天，在第3次注射后15天，实验组与对照组每只豚鼠各皮内注射0.1ml含500IUTB—PPD样品，连续观察3天，两组动物反应不应有明显区别。
2.8.5 纯度测定
应测定蛋白(凯氏定氮法)、多糖(蒽酮法)与核酸(紫外分光光度法)含量。蛋白含量应≥90%，多糖含量≤3%。
2.8.6 效价测定
TB—PPD标准品由中国药品生物制品检定所提供。
2.8.6.1 动物试验
将标准品及待检原液分别稀释马0.1ml含100IU、20IU及4IU或其他适宜的稀释度，用体重400～600g已致敏的白色雌性豚鼠最少4只，去毛后于背部脊柱两侧相对部位，分别皮内注射上述稀释度各0.1ml(从尾侧起先注射稀释度最高者)。于注射后24、48小时各观察结果1次(可根据48小时的反应结果判定)，算出待检和标准TB-PPD的平均硬结反应(纵横直径相加除2)计算累计值，并求其比值，比值1±0.2者为合格。
也可按WHO规程要求，标准品及待检样品分别稀释3个不同的适宜稀释度，用6只致敏豚鼠，以轮圈法注射于豚鼠背部两则，每侧3点，每点皮内注射0.1或0.2ml样品，用双盲法分别记录24及48小时局部硬结的纵径与横径。计算每个稀释度2天的总和(也可计算2天的平均面积)，并求其比值，比值1±0.2者为合格。
稀释度的选择应能使注射后24小时所产生的局部硬结反应直径不小于8mm，不大于25mm，两个样品的反应直径大致相同及两个样品的3个稀释度的剂量对数反应线应基本平行。
如待检样品效价与标准品效价不一致，可用同样方法重试一次，并算出相当于标准品的效价进行调整，调整后再重新抽样测定效价，直至合格。
2.8.6.2 人体反应测定
动物试验合格后，应进行小量人体测定，选择对TB—PPD1IU(好0.02μg结核蛋白)反应阳性的敏感成人最少5人或者皮内接种卡介苗12周后免疫效果观察的婴幼儿至少20人，每人于两前臂内侧相对部位分别注射5IU的标准品与待检样品各0.1ml，注射后72小时观察结果，并求其比值(计算方法与2.8.6.1项相同)。比值1±0.2，并无1例异常反应者为合格。
2.9 分装冻干
经物理检查、无菌试验、安全试验、致敏效应试验、蛋白质含量及效价测定合格后，即可根据蛋白质含量将原液进行定量稀释至规定浓度，然后定量分装安瓿，每安瓿装量为0.5ml，分装后立即进行冻干。每安瓿的分装误差应符合标准品的要求(差异系数不超过1%)。
冻干后抽样做成品检定，亦可将原液保存备用。
3 浓缩物检定
3.1 物理检查
冻干TB—PPD应为白色疏松体，无融化迹象。加入稀释液后，应于3分钟内全部溶解，呈棕黄色澄明液体，不得有不容物或杂质。
如系液体原液，亦应为棕黄色澄明液体，不应有不溶物或杂质。
3.2 水分测定
冻干制品水分含量应≤3%。
3.3 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
3.4 安全试验
按2.8.3项进行。
3.5 纯度测定
按2.8.5项进行。
3.6 致敏效应试验
按2.8.4项进行。
3.7 效价测定
动物试验按2.8.6.1项进行。人体反应测定按2.8.6.2项进行。但观察人数需增加1～2倍。
3.8 保存与效期
保存于2～8℃冷暗处。冻干制品自效价测定合格之日起效期为10年。液体原液自效价测定合格之日起效期为5年。
4 TB—PPD和稀释
4.1 稀释
经检定合格的浓缩物用内含0.0005%吐温80及0.3%苯酚的pH7.2～7.4的0.01mol的磷酸盐缓冲生理盐水稀释至20IU或50IU。
各处稀释用具应专用。加入TB—PPD后应充分摇匀，并逐瓶抽样作无菌试验，合格后分装。
4.2 分批
每次稀释的同一浓度的稀释TB—PPD为一批，同时有数瓶者，按瓶分为亚批。
4.3 分装
由专人用专用工具进行。
5 成品检定
5.1 物理检查
分装后应进行破漏、装量、外观检查。应为无色澄明液体，不得有不容物或杂质。
5.2 化学检查
pH值应为6.8～7.4。苯酚含量应为0.25%～0.5%。
5.3 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
5.4 防腐剂试验
用体重18～20g小白鼠2只，各皮下注射样品0.5ml，小白鼠震颤时间不得超过半小时，观察7天，不得有局部脓肿或死亡。
5.5 安全试验
每批用体重18～20g小白鼠5只，各腹腔注射样品0.5ml，观察1周，小白鼠应健康活存。
5.6 效价测定
按2.8.6.1项进行。比值1±0.2者为合格。
6 保存与效期
保存于2～8℃暗处。自稀释检定合格之日起效期为1年。
1 菌种
1.1 菌种由中国药品生物肉制品检定所分发或经同意。
1.2 制造TB-PPD用人型结核杆菌，菌号93009(H37Rv)。菌种应有完整的历史资料，经过全面检定，冻干保存。
1.3 应制备生产用菌种批，次级菌种批应控制在5代以内。
2 制造
全部生产过程，包括杀死分枝杆菌，应在完全隔离的区域内用专用设备进行。
2.1 制造用培养基
使用苏通马铃薯培养基，改良苏通综合培养基，或其他适宜培养基。培养基中应不含已知能对人或动物造成毒性和变态性反应的成分。
2.2 启开菌种(菌种批)反接种于苏通马铃薯培养基上。置37℃培养2～3周，可在苏通马铃薯培养基上再传一代或直接挑取苏通马铃薯管内生长良好的菌膜，移种于改良苏通综合培养基或其他适宜培养基的表面，置37℃静止培养1～2周，供大量接种用。
2.3 大量接种
挑取发育良好的菌膜移种于改良苏通综合培养基或其他适宜培养基的表面，置37℃静止培育8～10周。凡在培养期间或培养终止时，有菌膜下沉、发育异常或污染杂菌者，必须废弃。
2.4 杀菌
培养终止，将培养物加热，121℃30分钟进行杀菌处理。
2.5 除菌
杀菌后用滤器除去菌膜及菌体，收集滤液并取样做无菌试验，然后，加入0.3%苯酚或其他适宜的防腐剂。滤液保存在4～8℃，但要防止冻结。
2.6 提纯
用三氯乙酸和饱和硫酸铵法分别沉淀蛋白，加压过滤除去清液，并收集沉淀物于3μm孔径的滤膜上，然后用10%氯化钠液洗酸脱盐至中性为止，最后以磷酸盐缓冲液将沉淀物溶解，除菌过滤后即为原液。亦可采用其他适宜方法提纯。
2.7 分批
每次提纯的原液作为1亚批。最多将5个亚批混合组成为1批。
2.8 半成品检定
2.8.1 物理检查
原液应为深棕色的澄明液体，不应有沉淀物或其他杂质。
2.8.2 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
2.8.3 安全试验
用体重300～400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射原液1.0ml，观察6周，检查其症征或死亡。所有在试验后24小时内死亡的或表现出症征的动物应作镜检，然后将有关的组织镜检和培养，检查其有无分枝杆菌存在的证据。观察期中活存的动物也要以同样方法检查。
如果分析杆菌活菌培养试验阴性，在观察期中全部豚鼠健康存活，无一动物出现分枝杆菌的症征，则可判定浓缩原液通过试验。
如果未到观察期，任何动物死于非结核病因，本试验可复试一次。
2.8.4 致敏效应试验
实验组与对照组分别用体重300～400g未做过任何试验的健康豚鼠各3只，实验组每只豚鼠皮内注射0.1ml含500IUTB—PPD样品，共3次，每次间隔5天，在第3次注射后15天，实验组与对照组每只豚鼠各皮内注射0.1ml含500IUTB—PPD样品，连续观察3天，两组动物反应不应有明显区别。
2.8.5 纯度测定
应测定蛋白(凯氏定氮法)、多糖(蒽酮法)与核酸(紫外分光光度法)含量。蛋白含量应≥90%，多糖含量≤3%。
2.8.6 效价测定
TB—PPD标准品由中国药品生物制品检定所提供。
2.8.6.1 动物试验
将标准品及待检原液分别稀释马0.1ml含100IU、20IU及4IU或其他适宜的稀释度，用体重400～600g已致敏的白色雌性豚鼠最少4只，去毛后于背部脊柱两侧相对部位，分别皮内注射上述稀释度各0.1ml(从尾侧起先注射稀释度最高者)。于注射后24、48小时各观察结果1次(可根据48小时的反应结果判定)，算出待检和标准TB-PPD的平均硬结反应(纵横直径相加除2)计算累计值，并求其比值，比值1±0.2者为合格。
也可按WHO规程要求，标准品及待检样品分别稀释3个不同的适宜稀释度，用6只致敏豚鼠，以轮圈法注射于豚鼠背部两则，每侧3点，每点皮内注射0.1或0.2ml样品，用双盲法分别记录24及48小时局部硬结的纵径与横径。计算每个稀释度2天的总和(也可计算2天的平均面积)，并求其比值，比值1±0.2者为合格。
稀释度的选择应能使注射后24小时所产生的局部硬结反应直径不小于8mm，不大于25mm，两个样品的反应直径大致相同及两个样品的3个稀释度的剂量对数反应线应基本平行。
如待检样品效价与标准品效价不一致，可用同样方法重试一次，并算出相当于标准品的效价进行调整，调整后再重新抽样测定效价，直至合格。
2.8.6.2 人体反应测定
动物试验合格后，应进行小量人体测定，选择对TB—PPD1IU(好0.02μg结核蛋白)反应阳性的敏感成人最少5人或者皮内接种卡介苗12周后免疫效果观察的婴幼儿至少20人，每人于两前臂内侧相对部位分别注射5IU的标准品与待检样品各0.1ml，注射后72小时观察结果，并求其比值(计算方法与2.8.6.1项相同)。比值1±0.2，并无1例异常反应者为合格。
2.9 分装冻干
经物理检查、无菌试验、安全试验、致敏效应试验、蛋白质含量及效价测定合格后，即可根据蛋白质含量将原液进行定量稀释至规定浓度，然后定量分装安瓿，每安瓿装量为0.5ml，分装后立即进行冻干。每安瓿的分装误差应符合标准品的要求(差异系数不超过1%)。
冻干后抽样做成品检定，亦可将原液保存备用。
3 浓缩物检定
3.1 物理检查
冻干TB—PPD应为白色疏松体，无融化迹象。加入稀释液后，应于3分钟内全部溶解，呈棕黄色澄明液体，不得有不容物或杂质。
如系液体原液，亦应为棕黄色澄明液体，不应有不溶物或杂质。
3.2 水分测定
冻干制品水分含量应≤3%。
3.3 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
3.4 安全试验
按2.8.3项进行。
3.5 纯度测定
按2.8.5项进行。
3.6 致敏效应试验
按2.8.4项进行。
3.7 效价测定
动物试验按2.8.6.1项进行。人体反应测定按2.8.6.2项进行。但观察人数需增加1～2倍。
3.8 保存与效期
保存于2～8℃冷暗处。冻干制品自效价测定合格之日起效期为10年。液体原液自效价测定合格之日起效期为5年。
4 TB—PPD和稀释
4.1 稀释
经检定合格的浓缩物用内含0.0005%吐温80及0.3%苯酚的pH7.2～7.4的0.01mol的磷酸盐缓冲生理盐水稀释至20IU或50IU。
各处稀释用具应专用。加入TB—PPD后应充分摇匀，并逐瓶抽样作无菌试验，合格后分装。
4.2 分批
每次稀释的同一浓度的稀释TB—PPD为一批，同时有数瓶者，按瓶分为亚批。
4.3 分装
由专人用专用工具进行。
5 成品检定
5.1 物理检查
分装后应进行破漏、装量、外观检查。应为无色澄明液体，不得有不容物或杂质。
5.2 化学检查
pH值应为6.8～7.4。苯酚含量应为0.25%～0.5%。
5.3 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
5.4 防腐剂试验
用体重18～20g小白鼠2只，各皮下注射样品0.5ml，小白鼠震颤时间不得超过半小时，观察7天，不得有局部脓肿或死亡。
5.5 安全试验
每批用体重18～20g小白鼠5只，各腹腔注射样品0.5ml，观察1周，小白鼠应健康活存。
5.6 效价测定
按2.8.6.1项进行。比值1±0.2者为合格。
6 保存与效期
保存于2～8℃暗处。自稀释检定合格之日起效期为1年。