冻干基因工程α2a干扰素制造及检定规程
本品系用带有人α2a型干扰素基因重组质粒的大肠杆菌，经发酵培养及单克隆抗体亲和层析后精制而成。用于治疗某些病毒性疾病及部分肿瘤疾病。
1 菌种
1.1菌种来源
基因工程α2a干扰素工程菌由带有人α2a干扰素基因的重组质粒转化大肠杆菌而来。投产的工程菌需经卫生部批准。
1.2菌种特性
菌种表达稳定，表达水平符合投产菌种要求。
1.3制造用菌种库的建立
从原始菌种库传出，经扩大后冻干保存，或由上一代制造用菌种库传出，扩大后冻干保存作为制造用菌种库，但每次只限传三代。每批制造用菌种库均进行下列检定，合格后方可投产。
1.3.1划种LB琼脂平板
应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。
1.3.2涂片革兰氏染色
在光学显微镜下观察，应为典型的革兰氏阴性杆菌。
1.3.3对抗生素的抗性
应与原始菌株相符。
1.3.4电镜检查
应为典型大肠杆菌形态，并证明无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。
1.3.5生化反应
应符合大肠杆菌生物学性状。
1.3.6干扰素的表达量
在摇床培养，应符合原始菌种的表达量。
1.3.7质粒检查
应做该质粒的酶切图谱，并应与原始质粒相符。
1.3.8表达的干扰素型别
应用标准抗α干扰素血清做中和试验，证明型别正确。
1.4生产菌种
从制造用菌种库传出供生产用的菌种，称为生产菌种。
1.4.1生产菌种的制备及检定
取制造用菌种库冻干菌种开启后划种LB平板2～3块，培养后挑取平板中5～10个菌落，分别培养后保存，然后每个菌落分别进行干扰素表达量测定，至少重复一次，选出其中干扰素表达量最高的一份，供生产制备种子液用，其表达量应符合原始菌种的表达量。
1.5种子液
从生产菌种选出的菌种供做发酵用的称“种子液”。种子液的制备：将1.4.1项检定合格的生产菌种，根据实际需要做扩充传代，作为罐培养的种子液。
2 发酵培养
2.1空罐灭菌和实罐灭菌严格按照使用说明书要求操作。
2.2发酵培养基
应为适于发酵培养的培养基，根据菌种的抗生素抗性，培养若中允许加入少量抗生素，但应尽量避免含有β椖邗0防嗫股亍?/P>
2.3发酵培养参数
根据工程菌和发酵工艺要求设置和变换各项培养参数。
3 收集菌体
用离心法或其他适宜方法收集菌体，菌体可在?/FONT>20℃下保存1年。
4 菌体裂解
用盐酸胍或溶菌酶或高压匀浆泵等适宜方法裂解菌体。
5 制备粗制干扰素
菌体裂解后经离心所得上清液即为粗制干扰素。
6 纯化
粗制干扰素经单克隆抗体亲和层析等纯化步骤后即精制成“干扰素半成品原液”。
7 加白蛋白
取干扰素半成品原液检定合格后，立即另入适量人白蛋白保护剂，即为“加人白蛋白半成品”，保存于?/FONT>30℃。
8 稀释、除菌过滤
将“加人白蛋白半成品”用无热原生理盐水稀释至所需浓度，补加人白蛋白，使最终含量1%～2%。然后用0.22μm孔径滤膜除菌，除菌后抽样进行干扰素效价测定，热原质试验和无菌试验，合格后进行分装冻干。
9 分装、冻干
9.1 每支安瓿分装1ml，内含α2a干扰素100或300万IU。
9.2 冻干过程制品温度不得超过33℃。
9.3 冻干后成品置10℃以下干燥处保存，成品检定合格后进行包装。
10 半成品检定
每批半成品抽样进行10.1～10.8项检定。启开新菌种生产的前3批或生产条件有较大改变时进行10.9～10.12项检定。
10.1 效价测定
用细胞病变抑制法，Wish细胞/VSV为基本检测系统，用国家参考品校准为IU。
10.2 蛋白含量
用Lowry法测定。
10.3 比活性
应≥108Iumg蛋白。
10.4 纯度
10.4.1 电泳纯度
用非还原型SDS?/FONT>PAGE法，加样量不低于5μg，经扫描仪扫描纯度应在95%以上，聚合体不得超过10%。
10.4.2 高效液相色谱纯度
用280nm检测，应是一个吸收峰或主峰占总面积95%以上。
10.5 分子量
用还原型SDS?/FONT>PAGE法，加样量不低于5μg，α2a干扰素分子量应为19KD±10%。
10.6 残余外源性DNA含量
用同位素或生物素标记探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。
10.7 残余鼠IgG含量
用酶标或其他敏感方法测定，每剂量(20μg)的鼠IgG含量应在100ng以下。
10.8 残余工程菌蛋白含量
用酶标或其他敏感方法测定，残余工程菌蛋白不得超过总蛋白的0.02%。
10.9 残留抗生素活性
半成品中不应有残余抗生素活性存在。
10.10 肽图测定
应符合α2a型干扰素图形，批与批之间图形应一致。
10.11 等电聚集
测定等电点，α2a型干扰素等电点应5.7～6.7范围内。
10.12 紫外光谱扫描
检查半成品的吸收光谱，批与批之间应一致，α2a干扰素的最大吸收光谱应为280±3nm。
11 除菌半成品检定
11.1 效价测定
同10.1项。
11.2 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
11.3 热原质试验
按《生物制品热原质试验规程》进行，注射剂量按家兔体重注射20万IU/kg，判定标准按该规程4.1项要求进行。
12 成品检定
12.1 外观
应为白色或微黄色疏松体，另入1ml灭菌注射用水溶解后，不得含有肉眼可见的不溶物。
12.2 pH值
pH值应为6.5～7.5。
12.3 效价测定
同10.1项。其效价应为标示量的80%～150%。
12.4 水分含量
应≤3%(g/g)。
12.5 鉴别试验
用中和试验法，其抗病毒活性能被抗α2a型干扰素血清所中和或用免疫印染法。
12.6 HBsAg检测
用敏感度为1ng/ml以下的试剂盒测定，应为阴性。
12.7 无菌试验
同11.2项，每批抽样不少于10支。
12.8 热原质试验
同11.3项。
安全试验
12.9.1 豚鼠试验
用体重300～400g豚鼠2只，每只腹侧皮下注射干扰素1ml，观察7天，局部无红肿、坏死、体重增加者为合格。
12.9.2 小白鼠试验
用体重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射干扰素0.5ml，观察7天，动物全部存活，每只体重增加判为合格。
13 保存与效期
保存于10℃以下干燥处。自效价检定合格之日起效期为2年6个月。
1 菌种
1.1菌种来源
基因工程α2a干扰素工程菌由带有人α2a干扰素基因的重组质粒转化大肠杆菌而来。投产的工程菌需经卫生部批准。
1.2菌种特性
菌种表达稳定，表达水平符合投产菌种要求。
1.3制造用菌种库的建立
从原始菌种库传出，经扩大后冻干保存，或由上一代制造用菌种库传出，扩大后冻干保存作为制造用菌种库，但每次只限传三代。每批制造用菌种库均进行下列检定，合格后方可投产。
1.3.1划种LB琼脂平板
应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。
1.3.2涂片革兰氏染色
在光学显微镜下观察，应为典型的革兰氏阴性杆菌。
1.3.3对抗生素的抗性
应与原始菌株相符。
1.3.4电镜检查
应为典型大肠杆菌形态，并证明无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。
1.3.5生化反应
应符合大肠杆菌生物学性状。
1.3.6干扰素的表达量
在摇床培养，应符合原始菌种的表达量。
1.3.7质粒检查
应做该质粒的酶切图谱，并应与原始质粒相符。
1.3.8表达的干扰素型别
应用标准抗α干扰素血清做中和试验，证明型别正确。
1.4生产菌种
从制造用菌种库传出供生产用的菌种，称为生产菌种。
1.4.1生产菌种的制备及检定
取制造用菌种库冻干菌种开启后划种LB平板2～3块，培养后挑取平板中5～10个菌落，分别培养后保存，然后每个菌落分别进行干扰素表达量测定，至少重复一次，选出其中干扰素表达量最高的一份，供生产制备种子液用，其表达量应符合原始菌种的表达量。
1.5种子液
从生产菌种选出的菌种供做发酵用的称“种子液”。种子液的制备：将1.4.1项检定合格的生产菌种，根据实际需要做扩充传代，作为罐培养的种子液。
2 发酵培养
2.1空罐灭菌和实罐灭菌严格按照使用说明书要求操作。
2.2发酵培养基
应为适于发酵培养的培养基，根据菌种的抗生素抗性，培养若中允许加入少量抗生素，但应尽量避免含有β椖邗0防嗫股亍?/P>
2.3发酵培养参数
根据工程菌和发酵工艺要求设置和变换各项培养参数。
3 收集菌体
用离心法或其他适宜方法收集菌体，菌体可在?/FONT>20℃下保存1年。
4 菌体裂解
用盐酸胍或溶菌酶或高压匀浆泵等适宜方法裂解菌体。
5 制备粗制干扰素
菌体裂解后经离心所得上清液即为粗制干扰素。
6 纯化
粗制干扰素经单克隆抗体亲和层析等纯化步骤后即精制成“干扰素半成品原液”。
7 加白蛋白
取干扰素半成品原液检定合格后，立即另入适量人白蛋白保护剂，即为“加人白蛋白半成品”，保存于?/FONT>30℃。
8 稀释、除菌过滤
将“加人白蛋白半成品”用无热原生理盐水稀释至所需浓度，补加人白蛋白，使最终含量1%～2%。然后用0.22μm孔径滤膜除菌，除菌后抽样进行干扰素效价测定，热原质试验和无菌试验，合格后进行分装冻干。
9 分装、冻干
9.1 每支安瓿分装1ml，内含α2a干扰素100或300万IU。
9.2 冻干过程制品温度不得超过33℃。
9.3 冻干后成品置10℃以下干燥处保存，成品检定合格后进行包装。
10 半成品检定
每批半成品抽样进行10.1～10.8项检定。启开新菌种生产的前3批或生产条件有较大改变时进行10.9～10.12项检定。
10.1 效价测定
用细胞病变抑制法，Wish细胞/VSV为基本检测系统，用国家参考品校准为IU。
10.2 蛋白含量
用Lowry法测定。
10.3 比活性
应≥108Iumg蛋白。
10.4 纯度
10.4.1 电泳纯度
用非还原型SDS?/FONT>PAGE法，加样量不低于5μg，经扫描仪扫描纯度应在95%以上，聚合体不得超过10%。
10.4.2 高效液相色谱纯度
用280nm检测，应是一个吸收峰或主峰占总面积95%以上。
10.5 分子量
用还原型SDS?/FONT>PAGE法，加样量不低于5μg，α2a干扰素分子量应为19KD±10%。
10.6 残余外源性DNA含量
用同位素或生物素标记探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。
10.7 残余鼠IgG含量
用酶标或其他敏感方法测定，每剂量(20μg)的鼠IgG含量应在100ng以下。
10.8 残余工程菌蛋白含量
用酶标或其他敏感方法测定，残余工程菌蛋白不得超过总蛋白的0.02%。
10.9 残留抗生素活性
半成品中不应有残余抗生素活性存在。
10.10 肽图测定
应符合α2a型干扰素图形，批与批之间图形应一致。
10.11 等电聚集
测定等电点，α2a型干扰素等电点应5.7～6.7范围内。
10.12 紫外光谱扫描
检查半成品的吸收光谱，批与批之间应一致，α2a干扰素的最大吸收光谱应为280±3nm。
11 除菌半成品检定
11.1 效价测定
同10.1项。
11.2 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
11.3 热原质试验
按《生物制品热原质试验规程》进行，注射剂量按家兔体重注射20万IU/kg，判定标准按该规程4.1项要求进行。
12 成品检定
12.1 外观
应为白色或微黄色疏松体，另入1ml灭菌注射用水溶解后，不得含有肉眼可见的不溶物。
12.2 pH值
pH值应为6.5～7.5。
12.3 效价测定
同10.1项。其效价应为标示量的80%～150%。
12.4 水分含量
应≤3%(g/g)。
12.5 鉴别试验
用中和试验法，其抗病毒活性能被抗α2a型干扰素血清所中和或用免疫印染法。
12.6 HBsAg检测
用敏感度为1ng/ml以下的试剂盒测定，应为阴性。
12.7 无菌试验
同11.2项，每批抽样不少于10支。
12.8 热原质试验
同11.3项。
安全试验
12.9.1 豚鼠试验
用体重300～400g豚鼠2只，每只腹侧皮下注射干扰素1ml，观察7天，局部无红肿、坏死、体重增加者为合格。
12.9.2 小白鼠试验
用体重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射干扰素0.5ml，观察7天，动物全部存活，每只体重增加判为合格。
13 保存与效期
保存于10℃以下干燥处。自效价检定合格之日起效期为2年6个月。
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