《动脉粥样硬化》第四节　非酯化脂肪酸测定_亮度法

第四节　非酯化脂肪酸测定

     临床上将C₁₀以上的脂肪酸称为游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)或非酯化脂肪酸(nonesterifiedfatty acid,NFFA)，正常血清中含有油酸(18:1,W⁹)占54%，软脂酸(16：0)占34%，硬脂酸(18：0)占6%，是其主要的NFFA。另外还有月桂酸(12：0)、肉豆蔻酸(14：0)和花生四烯酸(20：4，W⁶^{，9，12，15})等含量很少的脂肪酸。与其他脂质比较，NFFA在血中浓度很低，其含量水平极易受脂代谢，糖代谢和内分泌机能等因素影响，血中NFFA半寿期为1～2min，极短。血清中的NFFA是与清蛋白结合进行运输，属于一种极简单的脂蛋白。

    测定血清NFFA法有滴定法。比色法，原子分光光度法，高压液相层析法和酶法等。一般多以酶法测定。作NFFA测定的标本一定要注意在4℃条件下分离血清并尽快进行测定。因为血中有各种脂肪酶存在，极易也极快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA，使血中NFFA值上升。贮存标本仅限于24h内，若保存三天，其值约升高30%，使结果不准确。

    1.非酶法测定

    非酶法测定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高压液相层析法。前三种方法准确性差；高压液相层析法，仪器太昂贵，不便于批量操作。

    2.酶测定法

    主要用脂肪酶测定。血清中游离脂肪酸可分别测定酶水解后的产物乙酰CoA或AMP或辅酶A(CoA)进行定量。酶法测定结果准确可靠，快速，易于批量检测。测定原理如图15-6所示。

    图15-6 血清主要FFA酶法测定图

    □：内物质作为生成量与变化量进行测定；ACS：乙酰CoA合成酶；MK：肌激酶； PK：丙酮酸激酶；POD：丙酮酸氧化酶；DTNB：α-磺基苯甲酸；ACO：乙酰CoA氧化酶；ACD：乙酰CoA脱氢酶。

    一、亮度法

    1.原理

    血清中游离脂肪酸经抽提到高密度铜试剂中，形成铜皂在上层溶剂中，再用二苯卡巴肼与铜显色，进行定量。

    2.试剂组成

    代号

    种类

    浓度

    组成

    贮存2～8℃

    有效期

    R-1

    抽提剂

    氯仿：庚烷：甲醇=5：5：1(V/V)

    R-2

    缓冲液

    33mmol/L

    KH₂PO₄4.539g/L 100ml+Na₂HPO₄·2H₂O5.983g/l 50ml调pH至6.4

    R-3

    铜贮液

    500mmol/L

    Cu(NO₃)₂·3H₂o 12.07g加H₂O→100ml

    R-4

    三乙醇胺

    1.0mol/L

    三乙醇胺10ml，加水→100ml

    R-5

    NaOH液

    1mol/L

    R-6

    铜试剂

    R-3 10ml+R-4 10ml+R-6 6ml

    +H₂O→100ml调pH至8.1

    R-7

    二苯卡

    巴肼液

    二苯卡巴肼(乙醇)液(4g/L)10ml+R-4 0.1ml

    临用前配制

    R-8

    软脂酸标准贮存液

    2mmol/L

    软脂酸51.2mg溶于100ml R-1液

    冷藏

    R-9

    R-8的应用液

    500μmol/L

    用R-1液稀释

    冷藏

    3.操作

    按图15-7操作。

    4.计算

    血清游离脂肪酸(μmol/L)=E_SA/E_ST×500

    二、酶法

    1.原理

    血清中游离脂肪酸或非酯化脂肪酸(NEFA)，经酶试剂作用生成紫色化合物，其颜色深浅与NEFA含量成正比。

    2.试剂组成

    代号

    种类

    组成

    浓度贮存

    贮存

    R1

    缓冲液

    磷酸缓冲液

    MgCl₂液

    去垢剂

    0.04mmol/LpH6.9

    3mol/L

    R2

    酶/辅酶

    乙酰CoA合成酶

    抗坏血酸氧化酶

    CoA

    ATP

    4-AAP

    溶于10ml R1液中

    ≥0.3U/ml

    ≥1.5U/ml

    0.9mmol/L

    5.0mmol/L

    1.5mmol/L

    冷藏5日

    R3

    酶稀释液

    苯氧乙醇

    去垢剂

    0.3%(V/V)

    R4

    马来酰亚胺

    该试剂与R3等体积混合

    10.6mmol/L

    R5

    酶试剂

    乙酰CoA氧化酶

    过氧化物酶

    TOOS

    混合上述试剂，再等体积R4试剂混合

    ≥10U/ml

    7.5U/ml

    0.2mmol/L

    冷藏5日

    R6

    标准液

    1mmol/L

    冷藏

    *应用带玻塞离心管

    3.操作

    按图15-8操作。

    4.计算

图15-7 血清非酯化脂肪酸测定(光度法)操作图

图15-8 血清非脂化脂肪酸测定(酶法)操作图

(胡汉宁储建中)

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