第四节 非酯化脂肪酸测定
临床上将C10以上的脂肪酸称为游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)或非酯化脂肪酸(nonesterifiedfatty acid,NFFA)，正常血清中含有油酸(18:1,W9)占54%，软脂酸(16：0)占34%，硬脂酸(18：0)占6%，是其主要的NFFA。另外还有月桂酸(12：0)、肉豆蔻酸(14：0)和花生四烯酸(20：4，W6，9，12，15)等含量很少的脂肪酸。与其他脂质比较，NFFA在血中浓度很低，其含量水平极易受脂代谢，糖代谢和内分泌机能等因素影响，血中NFFA半寿期为1～2min，极短。血清中的NFFA是与清蛋白结合进行运输，属于一种极简单的脂蛋白。
测定血清NFFA法有滴定法。比色法，原子分光光度法，高压液相层析法和酶法等。一般多以酶法测定。作NFFA测定的标本一定要注意在4℃条件下分离血清并尽快进行测定。因为血中有各种脂肪酶存在，极易也极快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA，使血中NFFA值上升。贮存标本仅限于24h内，若保存三天，其值约升高30%，使结果不准确。
1.非酶法测定
非酶法测定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高压液相层析法。前三种方法准确性差；高压液相层析法，仪器太昂贵，不便于批量操作。
2.酶测定法
主要用脂肪酶测定。血清中游离脂肪酸可分别测定酶水解后的产物乙酰CoA或AMP或辅酶A(CoA)进行定量。酶法测定结果准确可靠，快速，易于批量检测。测定原理如图15-6所示。
图15-6 血清主要FFA酶法测定图
□：内物质作为生成量与变化量进行测定；ACS：乙酰CoA合成酶；MK：肌激酶； PK：丙酮酸激酶；POD：丙酮酸氧化酶；DTNB：α-磺基苯甲酸；ACO：乙酰CoA氧化酶；ACD：乙酰CoA脱氢酶。
一、亮度法
1.原理
血清中游离脂肪酸经抽提到高密度铜试剂中，形成铜皂在上层溶剂中，再用二苯卡巴肼与铜显色，进行定量。
2.试剂组成
代号
种类
浓度
组成
贮存2～8℃
有效期
R-1
抽提剂
氯仿：庚烷：甲醇=5：5：1(V/V)
R-2
缓冲液
33mmol/L
KH2PO44.539g/L 100ml+Na2HPO4·2H2O5.983g/l 50ml调pH至6.4
R-3
铜贮液
500mmol/L
Cu(NO3)2·3H2o 12.07g加H2O→100ml
R-4
三乙醇胺
1.0mol/L
三乙醇胺10ml，加水→100ml
R-5
NaOH液
1mol/L
R-6
铜试剂
R-3 10ml+R-4 10ml+R-6 6ml
+H2O→100ml调pH至8.1
R-7
二苯卡
巴肼液
二苯卡巴肼(乙醇)液(4g/L)10ml+R-4 0.1ml
临用前配制
R-8
软脂酸标准贮存液
2mmol/L
软脂酸51.2mg溶于100ml R-1液
冷藏
R-9
R-8的应用液
500μmol/L
用R-1液稀释
冷藏
3.操作
按图15-7操作。
4.计算
血清游离脂肪酸(μmol/L)=ESA/EST×500
二、酶法
1.原理
血清中游离脂肪酸或非酯化脂肪酸(NEFA)，经酶试剂作用生成紫色化合物，其颜色深浅与NEFA含量成正比。
2.试剂组成
代号
种类
组成
浓度贮存
贮存
R1
缓冲液
磷酸缓冲液
MgCl2液
去垢剂
0.04mmol/LpH6.9
3mol/L
R2
酶/辅酶
乙酰CoA合成酶
抗坏血酸氧化酶
CoA
ATP
4-AAP
溶于10ml R1液中
≥0.3U/ml
≥1.5U/ml
0.9mmol/L
5.0mmol/L
1.5mmol/L
冷藏5日
R3
酶稀释液
苯氧乙醇
去垢剂
0.3%(V/V)
R4
马来酰亚胺
该试剂与R3等体积混合
10.6mmol/L
R5
酶试剂
乙酰CoA氧化酶
过氧化物酶
TOOS
混合上述试剂，再等体积R4试剂混合
≥10U/ml
7.5U/ml
0.2mmol/L
冷藏5日
R6
标准液
1mmol/L
冷藏
*应用带玻塞离心管
3.操作
按图15-8操作。
4.计算
图15-7 血清非酯化脂肪酸测定(光度法)操作图
图15-8 血清非脂化脂肪酸测定(酶法)操作图
(胡汉宁 储建中)
测定血清NFFA法有滴定法。比色法，原子分光光度法，高压液相层析法和酶法等。一般多以酶法测定。作NFFA测定的标本一定要注意在4℃条件下分离血清并尽快进行测定。因为血中有各种脂肪酶存在，极易也极快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA，使血中NFFA值上升。贮存标本仅限于24h内，若保存三天，其值约升高30%，使结果不准确。
1.非酶法测定
非酶法测定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高压液相层析法。前三种方法准确性差；高压液相层析法，仪器太昂贵，不便于批量操作。
2.酶测定法
主要用脂肪酶测定。血清中游离脂肪酸可分别测定酶水解后的产物乙酰CoA或AMP或辅酶A(CoA)进行定量。酶法测定结果准确可靠，快速，易于批量检测。测定原理如图15-6所示。
图15-6 血清主要FFA酶法测定图
□：内物质作为生成量与变化量进行测定；ACS：乙酰CoA合成酶；MK：肌激酶； PK：丙酮酸激酶；POD：丙酮酸氧化酶；DTNB：α-磺基苯甲酸；ACO：乙酰CoA氧化酶；ACD：乙酰CoA脱氢酶。
一、亮度法
1.原理
血清中游离脂肪酸经抽提到高密度铜试剂中，形成铜皂在上层溶剂中，再用二苯卡巴肼与铜显色，进行定量。
2.试剂组成
代号
种类
浓度
组成
贮存2～8℃
有效期
R-1
抽提剂
氯仿：庚烷：甲醇=5：5：1(V/V)
R-2
缓冲液
33mmol/L
KH2PO44.539g/L 100ml+Na2HPO4·2H2O5.983g/l 50ml调pH至6.4
R-3
铜贮液
500mmol/L
Cu(NO3)2·3H2o 12.07g加H2O→100ml
R-4
三乙醇胺
1.0mol/L
三乙醇胺10ml，加水→100ml
R-5
NaOH液
1mol/L
R-6
铜试剂
R-3 10ml+R-4 10ml+R-6 6ml
+H2O→100ml调pH至8.1
R-7
二苯卡
巴肼液
二苯卡巴肼(乙醇)液(4g/L)10ml+R-4 0.1ml
临用前配制
R-8
软脂酸标准贮存液
2mmol/L
软脂酸51.2mg溶于100ml R-1液
冷藏
R-9
R-8的应用液
500μmol/L
用R-1液稀释
冷藏
3.操作
按图15-7操作。
4.计算
血清游离脂肪酸(μmol/L)=ESA/EST×500
二、酶法
1.原理
血清中游离脂肪酸或非酯化脂肪酸(NEFA)，经酶试剂作用生成紫色化合物，其颜色深浅与NEFA含量成正比。
2.试剂组成
代号
种类
组成
浓度贮存
贮存
R1
缓冲液
磷酸缓冲液
MgCl2液
去垢剂
0.04mmol/LpH6.9
3mol/L
R2
酶/辅酶
乙酰CoA合成酶
抗坏血酸氧化酶
CoA
ATP
4-AAP
溶于10ml R1液中
≥0.3U/ml
≥1.5U/ml
0.9mmol/L
5.0mmol/L
1.5mmol/L
冷藏5日
R3
酶稀释液
苯氧乙醇
去垢剂
0.3%(V/V)
R4
马来酰亚胺
该试剂与R3等体积混合
10.6mmol/L
R5
酶试剂
乙酰CoA氧化酶
过氧化物酶
TOOS
混合上述试剂，再等体积R4试剂混合
≥10U/ml
7.5U/ml
0.2mmol/L
冷藏5日
R6
标准液
1mmol/L
冷藏
*应用带玻塞离心管
3.操作
按图15-8操作。
4.计算
图15-7 血清非酯化脂肪酸测定(光度法)操作图
图15-8 血清非脂化脂肪酸测定(酶法)操作图
(胡汉宁 储建中)
相关目录
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第十六章 血浆脂蛋白的分离纯化及定量
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