《动脉粥样硬化》第一节　胆固醇测定

第一节　胆固醇测定

     血清中胆固醇包括CE和FC，酯型的CE占70%，FC占30%。CE中的C₃的-OH在LCAT作用下，可分别结合亚油酸(43%)、油酸(24%)、软脂酸(10%)、亚麻油酸(6%)、花生四烯酸(6%)、硬脂酸(3%)等脂肪酸结合而成。血清中胆固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL、CM最少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。

    1.化学法

    化学法一般包括：①抽提；②皂化；③毛地黄皂苷沉淀纯化；④显色比色四个阶段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通过①～④步骤操作过程。常规操作中多采用省去了②、③。或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法，现将此法作为标准参考方法予以引用。

    2.酵法测定

    CE在胆固醇酯酶(cholesterolesterase)作用下水解成FC和NFFA，TC再经胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase,COD)氧化成△4胆甾烯酮和H₂O₂。再分别定量O₂的消耗或者H₂O₂的生成量，或者△4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。该法是目前常规的应用方法，快速准确，标本用量少，便于自动生化分析仪作批量测定。

    一、Abell-Kendall改良法

    1.原理

    血清加入醇溶性氢氧化钾，使胆固醇从脂蛋白中分离出来，同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇，加石油醚振摇、抽提，使胆固醇移入石油醚层，分离并取一定量的石油醚层，蒸发至干，再进行Liebermann-Burchard 显色反应，620nm比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。

    2.试剂组成

    代号

    种类

    浓度

    组成

    贮存2～8℃

    有效时间

    R1

    乙醇

    优质纯

    R2

    石油醚

    沸点68℃，特级纯

    R3

    水醋酸

    分析纯

    R4

    无水醋酸

    胆固醇分析用，不含HCI

    R5

    浓硫酸

    分析纯

    R6

    KOH液

    33%(W/W)

    KOH10g+H₂O20ml

    R7

    乙醇性KOH液

    R194ml+R66ml

    临用前配制

    R8

    Liebermann

    配制后

    Burchard

    R420体积+R51体积+R310体积

    1h

    试剂*

    内用完

    R9

    胆固醇标准液

    5.17mmol/L

    胆固醇标准品200mg+R1→100ml

    0

    *：在三角烧瓶内，加入无水醋酸，于冰水中冷至10℃以下，再慢慢加入浓硫酸，混合，静置10min，又加冰醋酸混匀，备用。

    3.操作

    图15-1 血清胆固醇(Abell法)测定操作图

    按图15-1操作。

    4.计算

    标准总胆固醇浓度=E_SA/E_ST×5.17(mmol/L)

    二、酶法(CEH、COD-POD法)

    首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶(CEH)水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇在胆固醇氧化酶(COD)作用下，生成△4-胆甾烯酮和H₂O₂，再H₂O₂经过氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替比林(4-AA-P)及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS)参与下，生成红色醌亚胺色素。

    H₂O₂+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素

    (一)手工测定法

    1.试剂组成

    代号

    种类

    浓度

    组成

    贮2～8℃

    有效时间

    Na₂HPO₄

    50mmol/L

    Na₂H₂PO₄

    50mmol/L

    胆酸钠

    3mmol/L

    4-氨基安替比林

    0.82mmol/L

    R1*

    ESPAS

    14mmol/L

    24h

    Carbowax-6000

    0.17mmol/L

    CEH

    33U/L

    COD

    117U/L

    POD

    6700U/L

    R2

    标准液

    5.17mmol/L

    用异丙醇溶解胆固醇

    *混匀，调pH至6.70±0.10(25℃)，或购买试剂盒。酶以活性单位表示。

    2.操作

    按图15-2操作。

    3.计算

    标准总胆固醇浓度=E_SA/E_ST×5.17(mmol/L)

    (二)自动化分析仪测定

    以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。

    1.试剂组成

    A液：CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。

    B液：COD、4-氨基安替比林等。

    图15-2 血清胆固醇测定(酶法)操作图

    2.上机参数

    项目

    参数

    方法

    终点法

    波长

    双波长(540nm，700nm)

    反应温度

    37℃

    试剂A反应时间

    2～3min

    试剂B反应时间

    5～6min

    样本用量

    3μl

    试剂A用量

    250μl

    试剂B用量

    120μl

    单位

    mmol/L

    3.操作过程

    4.计算

    以△A=A2-A1，根据同样处理之标准或质控物计算，打印结果。

    5.注意事项

    (1)试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。

    (2)试剂在有效内2～8℃避光食保存。

    (3)胆固醇含量超过200mmol/L，需用生理盐水稀释再测。

百拇医药网 http://book.100md.com/tcm/dongmaizhouyangyinghua/17_01.htm

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