第一节 胆固醇测定
血清中胆固醇包括CE和FC，酯型的CE占70%，FC占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下，可分别结合亚油酸(43%)、油酸(24%)、软脂酸(10%)、亚麻油酸(6%)、花生四烯酸(6%)、硬脂酸(3%)等脂肪酸结合而成。血清中胆固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL、CM最少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。
1.化学法
化学法一般包括：①抽提；②皂化；③毛地黄皂苷沉淀纯化；④显色比色四个阶段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通过①～④步骤操作过程。常规操作中多采用省去了②、③。或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法，现将此法作为标准参考方法予以引用。
2.酵法测定
CE在胆固醇酯酶(cholesterolesterase)作用下水解成FC和NFFA，TC再经胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase,COD)氧化成△4胆甾烯酮和H2O2。再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者△4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。该法是目前常规的应用方法，快速准确，标本用量少，便于自动生化分析仪作批量测定。
一、Abell-Kendall改良法
1.原理
血清加入醇溶性氢氧化钾，使胆固醇从脂蛋白中分离出来，同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇，加石油醚振摇、抽提，使胆固醇移入石油醚层，分离并取一定量的石油醚层，蒸发至干，再进行Liebermann-Burchard 显色反应，620nm比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。
2.试剂组成
代号
种类
浓度
组 成
贮存2～8℃
有效时间
R1
乙醇
优质纯
R2
石油醚
沸点68℃，特级纯
R3
水醋酸
分析纯
R4
无水醋酸
胆固醇分析用，不含HCI
R5
浓硫酸
分析纯
R6
KOH液
33%(W/W)
KOH10g+H2O20ml
R7
乙醇性KOH液
R194ml+R66ml
临用前配制
R8
Liebermann
配制后
Burchard
R420体积+R51体积+R310体积
1h
试剂*
内用完
R9
胆固醇标准液
5.17mmol/L
胆固醇标准品200mg+R1→100ml
0
*：在三角烧瓶内，加入无水醋酸，于冰水中冷至10℃以下，再慢慢加入浓硫酸，混合，静置10min，又加冰醋酸混匀，备用。
3.操作
图15-1 血清胆固醇(Abell法)测定操作图
按图15-1操作。
4.计算
标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
二、酶法(CEH、COD-POD法)
首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶(CEH)水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇在胆固醇氧化酶(COD)作用下，生成△4-胆甾烯酮和H2O2，再H2O2经过氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替比林(4-AA-P)及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS)参与下，生成红色醌亚胺色素。
H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素
(一)手工测定法
1.试剂组成
代号
种类
浓度
组成
贮2～8℃
有效时间
Na2HPO4
50mmol/L
Na2H2PO4
50mmol/L
胆酸钠
3mmol/L
4-氨基安替比林
0.82mmol/L
R1*
ESPAS
14mmol/L
24h
Carbowax-6000
0.17mmol/L
CEH
33U/L
COD
117U/L
POD
6700U/L
R2
标准液
5.17mmol/L
用异丙醇溶解胆固醇
*混匀，调pH至6.70±0.10(25℃)，或购买试剂盒。酶以活性单位表示。
2.操作
按图15-2操作。
3.计算
标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
(二)自动化分析仪测定
以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。
1.试剂组成
A液：CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。
B液：COD、4-氨基安替比林等。
图15-2 血清胆固醇测定(酶法)操作图
2.上机参数
项 目
参 数
方 法
终点法
波 长
双波长(540nm，700nm)
反应温度
37℃
试剂A反应时间
2～3min
试剂B反应时间
5～6min
样本用量
3μl
试剂A用量
250μl
试剂B用量
120μl
单位
mmol/L
3.操作过程
4.计算
以△A=A2-A1，根据同样处理之标准或质控物计算，打印结果。
5.注意事项
(1)试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。
(2)试剂在有效内2～8℃避光食保存。
(3)胆固醇含量超过200mmol/L，需用生理盐水稀释再测。
1.化学法
化学法一般包括：①抽提；②皂化；③毛地黄皂苷沉淀纯化；④显色比色四个阶段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通过①～④步骤操作过程。常规操作中多采用省去了②、③。或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法，现将此法作为标准参考方法予以引用。
2.酵法测定
CE在胆固醇酯酶(cholesterolesterase)作用下水解成FC和NFFA，TC再经胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase,COD)氧化成△4胆甾烯酮和H2O2。再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者△4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。该法是目前常规的应用方法，快速准确，标本用量少，便于自动生化分析仪作批量测定。
一、Abell-Kendall改良法
1.原理
血清加入醇溶性氢氧化钾，使胆固醇从脂蛋白中分离出来，同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇，加石油醚振摇、抽提，使胆固醇移入石油醚层，分离并取一定量的石油醚层，蒸发至干，再进行Liebermann-Burchard 显色反应，620nm比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。
2.试剂组成
代号
种类
浓度
组 成
贮存2～8℃
有效时间
R1
乙醇
优质纯
R2
石油醚
沸点68℃，特级纯
R3
水醋酸
分析纯
R4
无水醋酸
胆固醇分析用，不含HCI
R5
浓硫酸
分析纯
R6
KOH液
33%(W/W)
KOH10g+H2O20ml
R7
乙醇性KOH液
R194ml+R66ml
临用前配制
R8
Liebermann
配制后
Burchard
R420体积+R51体积+R310体积
1h
试剂*
内用完
R9
胆固醇标准液
5.17mmol/L
胆固醇标准品200mg+R1→100ml
0
*：在三角烧瓶内，加入无水醋酸，于冰水中冷至10℃以下，再慢慢加入浓硫酸，混合，静置10min，又加冰醋酸混匀，备用。
3.操作
图15-1 血清胆固醇(Abell法)测定操作图
按图15-1操作。
4.计算
标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
二、酶法(CEH、COD-POD法)
首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶(CEH)水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇在胆固醇氧化酶(COD)作用下，生成△4-胆甾烯酮和H2O2，再H2O2经过氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替比林(4-AA-P)及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS)参与下，生成红色醌亚胺色素。
H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素
(一)手工测定法
1.试剂组成
代号
种类
浓度
组成
贮2～8℃
有效时间
Na2HPO4
50mmol/L
Na2H2PO4
50mmol/L
胆酸钠
3mmol/L
4-氨基安替比林
0.82mmol/L
R1*
ESPAS
14mmol/L
24h
Carbowax-6000
0.17mmol/L
CEH
33U/L
COD
117U/L
POD
6700U/L
R2
标准液
5.17mmol/L
用异丙醇溶解胆固醇
*混匀，调pH至6.70±0.10(25℃)，或购买试剂盒。酶以活性单位表示。
2.操作
按图15-2操作。
3.计算
标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
(二)自动化分析仪测定
以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。
1.试剂组成
A液：CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。
B液：COD、4-氨基安替比林等。
图15-2 血清胆固醇测定(酶法)操作图
2.上机参数
项 目
参 数
方 法
终点法
波 长
双波长(540nm，700nm)
反应温度
37℃
试剂A反应时间
2～3min
试剂B反应时间
5～6min
样本用量
3μl
试剂A用量
250μl
试剂B用量
120μl
单位
mmol/L
3.操作过程
4.计算
以△A=A2-A1，根据同样处理之标准或质控物计算，打印结果。
5.注意事项
(1)试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。
(2)试剂在有效内2～8℃避光食保存。
(3)胆固醇含量超过200mmol/L，需用生理盐水稀释再测。