人用浓缩狂犬病疫苗制造及检定规程
本品系用狂犬病固定毒(aG)适应株接种原代地鼠肾单层细胞，培养后收获病毒液，加入甲醛溶液灭活后浓缩，再加氢氧化铝制成。用于预防狂犬病。
1 毒种
1.1 毒种来源
狂犬病固定毒aG适应株系用狂犬病固定毒北京株先在地鼠肾细胞传代适应后，再通过豚鼠脑内交替传代适应而成。由中国药品生物制品检定所检定、保存与分发。生产用毒种传代应不超过10aG交替代。
1.2 毒种检定
1.2.1无菌试验
aG毒种每次传代收剖后均须做无菌试验，合格者方可使用。
1.2.2病毒滴定
aG毒种用体重11～13g小白鼠进行脑内病毒滴定，滴度≥8.0LogLD50/1.0ml方可用于生产。
1.2.3纯毒试验
生产前和生产末期用小白鼠做脑内法中和试验，以鉴定毒种的特异性。所用特异性抗血清由中国药品生物制品检定所提供。中和指数必须在500以上。生产过程中如对毒种发生疑问，应及时进行鉴定。
1.3 毒种传代
选择体重120～160g健康豚鼠，脑内注射，选潜伏期80～100小时具有典型狂犬病症状者放血致死，无菌取脑。豚鼠脑连续传代不超过5代。
1.4 毒种保存
供生产用aG株在-60℃以下保存，不得超过1年。
2 疫苗制造
2.1 细胞制备
2.1.1地鼠
选用12～14日龄健康地鼠，如腹腔有充血、渗出液、肾脏异常等应废弃。
2.1.2解剖
处死地鼠，用消毒液洗涤皮毛数次，末次浸泡一定时间，无菌取肾，置于瓶中剪碎。
2.1.3细胞消化及分装
将剪碎肾块洗涤数次，加入适量胰蛋白酶消化液，置2～8℃过夜(约16～20小时)或37℃水浴消化适当时间，弃去消化液，经洗液洗涤2～3次，振摇或吹打分散细胞，加入适量生长液，分装培养瓶，置37℃±0.5℃培养长成单层。
2.1.4使用液体
均不得含青霉素或其他β内酰胺类抗生素。
2.1.4.1生长液
为含不超过10%小牛血清水解乳蛋白SMI液或其他适宜培养液，可加入适量抗生素。
2.1.4.2浸泡液
为水解乳蛋白SMI液或其他适宜培养液，其中保护剂可选用0.1%以上人白蛋白，可加入适量抗生素。
2.1.4.3维持液
为199或其他适宜的溶液，其中保护剂中可选用0.4%以上人白蛋白，可加入适量抗生素。
2.1.5外源因子检查
每生产批细胞留5%(或不少于500ml)悬液作为对照细胞检查外源病毒。该细胞除不接种病毒外，细胞浓度和处理均与生产过程平行进行。至原液收获之日用显微镜观察，应无病变发生。并用0.2%～0.5%豚鼠红细胞(4℃保存不超过7天)进行血吸附试验，置4～8℃30分钟判定结果；再置20～25℃30分钟再次判定结果，均应为阴性。如有可疑病变或血吸附可疑阳性，在同种细胞上继续盲传，如传出病毒，该批细胞制备的疫苗应予废弃。
2.2 病毒接种和病毒液收获
2.2.1病毒接种
将长成单层细胞瓶倾去营养液，换入浸泡液。同时将无菌试验合格的aG株摇碎后，经1000r/min离心10分钟，吸取上清液按1∶1000～1∶4000种入细胞瓶，也可将细胞与病毒同时接种，置32～37℃继续培养。
2.2.2洗换
种毒后吸附适当时间倾去浸泡液，用Hanks液或其他适宜液体洗涤细胞，然后换入维持液，置32～37℃继续培育。
2.2.3病毒液收获
洗换后观察细胞生长情况，选择适当天数收获病毒液，取样品做病毒滴定及无菌试验。
2.2.4病毒滴定
将样品做10倍系列稀释，取3个稀释度的病毒液，每个稀释度用体重11～13g小白鼠4只，每只脑内接种0.03ml，逐日观察，14日判定结果，计算LD50(3日内死亡者不计)。滴度要求在5.5LogLD50/1.0ml以上。可重试1次。
2.3 灭活
病毒液内加入1/4000～1/5000的甲醛溶液，置32～37℃或2～8℃或其他适宜温度灭活一定时间。
2.4 过滤合并
将无菌试验合格的病毒液用滤球或绢布过滤后合并即为原液。
2.5 防腐剂
按0.005%～0.01%加入硫柳汞。
2.6 超滤浓缩
原液按其滴度进行不同倍数浓缩。按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验。
3 疫苗剂型
3.1 液体浓缩疫苗
病毒液灭活经超滤浓缩后再加入Al(OH)3，使最终含量为0.4～ 0.7mg/ml。
3.2 冻干浓缩疫苗
用适当方法进行超滤或精制，然后冻干。
3.2.1冻干保护剂
1%明胶和5%蔗糖或其他适宜保护剂。
3.2.2疫苗稀释
将保护剂按比例加入疫苗内，充分摇匀，取样做冻干前无菌试验后立即分装与冻干。
4 半成品检定
4.1 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
4.2 灭活试验
将样品脑内接种体重11～13g小白鼠10只，每只0.03ml，观察14天，应健存，非特异死亡不超过20%。小白鼠如发病死亡，可继续灭活并进行灭活试验。
4.3 残余牛血清蛋白含量
用检定所认可的试剂和方法测定，液体浓缩疫苗与冻干浓缩疫苗牛血清蛋白含量应≤50ng/ml。
5 分装
半成品检定合格后即可进行分装。液体浓缩疫苗每支装量2ml，冻干浓缩疫苗每支装量1ml或2ml。
6 成品检定
6.1 效力试验
由质量检定部门进行。
6.1.1攻击毒株
攻击毒株(CVS)由中国药品生物制品检定所发给。
6.1.2击毒株的制备
6.1.2.1启开冻干毒种：稀释成10-2悬液，用体重11～13g小白鼠，脑内接种0.03ml，连续传2～3代，收脑时应选择4～5天有典型狂病症状的脑组织，放-60℃低温保存。
6.1.2.2病毒悬液的制备：将鼠脑研磨并加入适量正常马血清或小牛血清蒸馏水，制成20%悬液，经1000r/min沉淀10分钟，吸取上清液分装安瓿或小管，储存于-60℃冰箱中，经用体重18～20g小白鼠做病毒滴定，符合要求后，方可作攻击毒用。
6.1.3疫苗参考对照品。
由检定所定期发给。
6.1.4待检疫苗
取同批安全试验合格疫苗用pH7.6PBS做5倍连续稀释，一般采用3个稀释度以上进行免疫，如1∶5、1∶25、1∶125的稀释度。
6.1.5免疫
选用体重12～14g的小白鼠，免疫时应同时有参考对照品的对照和攻击病毒LD50测定的对照小白鼠，参考对照品可做1∶25、1∶125和1∶625共3个稀释度进行免疫，每只小白鼠腹腔注射0.5ml，间隔一周再免疫一次，免疫时将疫苗保存在冰浴中，各组小白鼠都应在同样的条件下饲养。
6.1.6攻击
小白鼠于第一次免疫后14天，用预先测定含5～100个LD50的病毒量脑内攻击0.03ml/只。病毒测定用10-0、10-1、10-2、10-3，每稀释度不少于8只，疫苗免疫组小白鼠每个稀释度为14～16只，所有小白鼠自攻击之日起观察14天。第5天后死亡和呈现典型脑病症状也作为因狂犬病死亡而计算在内。
6.1.7判定结果和合格指标
要求原病毒悬液注射的小白鼠80%以上死亡，攻击病毒含量为5～100个LD50。液体浓缩疫苗合格指标应≥2.5IU/安瓿(2ml)，冻干浓缩疫苗应≥2.5IU/安瓿(1ml或2ml)。疫苗不合格可复试一次。
6.2 物理检查
液体浓缩疫苗应为橘红-紫红色混浊液体，久放形成可摇散的沉淀。冻干浓缩疫苗为淡黄色疏松体。
6.3 化学测定
按《生物制品化学检定规程》进行。
6.3.1 pH值
pH值应为7.2～8.0。
6.3.2氢氧化铝含量
不得超过0.7mg/ml。
6.3.3硫柳汞含量
不得超过0.01%。
6.3.4游离甲醛含量
不得超过0.015%。
6.3.5水分
冻干疫苗水分不得超过3.5%。
6.4 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
6.5 毒性试验
取疫苗接种11～13g小白鼠10只，每只腹腔注射0.5ml，观察7天，应健存。
6.6 稀释液
冻干浓缩疫苗用灭菌注射用水或其他适宜稀释液稀释，其质量应符合《中国药典》规定。
7 保存与效期
疫苗应保存于2～8℃。液体浓缩疫苗由效力合格之日起效期为1年，冻干浓缩疫苗由冻干之日起，效期为2年。
1 毒种
1.1 毒种来源
狂犬病固定毒aG适应株系用狂犬病固定毒北京株先在地鼠肾细胞传代适应后，再通过豚鼠脑内交替传代适应而成。由中国药品生物制品检定所检定、保存与分发。生产用毒种传代应不超过10aG交替代。
1.2 毒种检定
1.2.1无菌试验
aG毒种每次传代收剖后均须做无菌试验，合格者方可使用。
1.2.2病毒滴定
aG毒种用体重11～13g小白鼠进行脑内病毒滴定，滴度≥8.0LogLD50/1.0ml方可用于生产。
1.2.3纯毒试验
生产前和生产末期用小白鼠做脑内法中和试验，以鉴定毒种的特异性。所用特异性抗血清由中国药品生物制品检定所提供。中和指数必须在500以上。生产过程中如对毒种发生疑问，应及时进行鉴定。
1.3 毒种传代
选择体重120～160g健康豚鼠，脑内注射，选潜伏期80～100小时具有典型狂犬病症状者放血致死，无菌取脑。豚鼠脑连续传代不超过5代。
1.4 毒种保存
供生产用aG株在-60℃以下保存，不得超过1年。
2 疫苗制造
2.1 细胞制备
2.1.1地鼠
选用12～14日龄健康地鼠，如腹腔有充血、渗出液、肾脏异常等应废弃。
2.1.2解剖
处死地鼠，用消毒液洗涤皮毛数次，末次浸泡一定时间，无菌取肾，置于瓶中剪碎。
2.1.3细胞消化及分装
将剪碎肾块洗涤数次，加入适量胰蛋白酶消化液，置2～8℃过夜(约16～20小时)或37℃水浴消化适当时间，弃去消化液，经洗液洗涤2～3次，振摇或吹打分散细胞，加入适量生长液，分装培养瓶，置37℃±0.5℃培养长成单层。
2.1.4使用液体
均不得含青霉素或其他β内酰胺类抗生素。
2.1.4.1生长液
为含不超过10%小牛血清水解乳蛋白SMI液或其他适宜培养液，可加入适量抗生素。
2.1.4.2浸泡液
为水解乳蛋白SMI液或其他适宜培养液，其中保护剂可选用0.1%以上人白蛋白，可加入适量抗生素。
2.1.4.3维持液
为199或其他适宜的溶液，其中保护剂中可选用0.4%以上人白蛋白，可加入适量抗生素。
2.1.5外源因子检查
每生产批细胞留5%(或不少于500ml)悬液作为对照细胞检查外源病毒。该细胞除不接种病毒外，细胞浓度和处理均与生产过程平行进行。至原液收获之日用显微镜观察，应无病变发生。并用0.2%～0.5%豚鼠红细胞(4℃保存不超过7天)进行血吸附试验，置4～8℃30分钟判定结果；再置20～25℃30分钟再次判定结果，均应为阴性。如有可疑病变或血吸附可疑阳性，在同种细胞上继续盲传，如传出病毒，该批细胞制备的疫苗应予废弃。
2.2 病毒接种和病毒液收获
2.2.1病毒接种
将长成单层细胞瓶倾去营养液，换入浸泡液。同时将无菌试验合格的aG株摇碎后，经1000r/min离心10分钟，吸取上清液按1∶1000～1∶4000种入细胞瓶，也可将细胞与病毒同时接种，置32～37℃继续培养。
2.2.2洗换
种毒后吸附适当时间倾去浸泡液，用Hanks液或其他适宜液体洗涤细胞，然后换入维持液，置32～37℃继续培育。
2.2.3病毒液收获
洗换后观察细胞生长情况，选择适当天数收获病毒液，取样品做病毒滴定及无菌试验。
2.2.4病毒滴定
将样品做10倍系列稀释，取3个稀释度的病毒液，每个稀释度用体重11～13g小白鼠4只，每只脑内接种0.03ml，逐日观察，14日判定结果，计算LD50(3日内死亡者不计)。滴度要求在5.5LogLD50/1.0ml以上。可重试1次。
2.3 灭活
病毒液内加入1/4000～1/5000的甲醛溶液，置32～37℃或2～8℃或其他适宜温度灭活一定时间。
2.4 过滤合并
将无菌试验合格的病毒液用滤球或绢布过滤后合并即为原液。
2.5 防腐剂
按0.005%～0.01%加入硫柳汞。
2.6 超滤浓缩
原液按其滴度进行不同倍数浓缩。按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验。
3 疫苗剂型
3.1 液体浓缩疫苗
病毒液灭活经超滤浓缩后再加入Al(OH)3，使最终含量为0.4～ 0.7mg/ml。
3.2 冻干浓缩疫苗
用适当方法进行超滤或精制，然后冻干。
3.2.1冻干保护剂
1%明胶和5%蔗糖或其他适宜保护剂。
3.2.2疫苗稀释
将保护剂按比例加入疫苗内，充分摇匀，取样做冻干前无菌试验后立即分装与冻干。
4 半成品检定
4.1 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
4.2 灭活试验
将样品脑内接种体重11～13g小白鼠10只，每只0.03ml，观察14天，应健存，非特异死亡不超过20%。小白鼠如发病死亡，可继续灭活并进行灭活试验。
4.3 残余牛血清蛋白含量
用检定所认可的试剂和方法测定，液体浓缩疫苗与冻干浓缩疫苗牛血清蛋白含量应≤50ng/ml。
5 分装
半成品检定合格后即可进行分装。液体浓缩疫苗每支装量2ml，冻干浓缩疫苗每支装量1ml或2ml。
6 成品检定
6.1 效力试验
由质量检定部门进行。
6.1.1攻击毒株
攻击毒株(CVS)由中国药品生物制品检定所发给。
6.1.2击毒株的制备
6.1.2.1启开冻干毒种：稀释成10-2悬液，用体重11～13g小白鼠，脑内接种0.03ml，连续传2～3代，收脑时应选择4～5天有典型狂病症状的脑组织，放-60℃低温保存。
6.1.2.2病毒悬液的制备：将鼠脑研磨并加入适量正常马血清或小牛血清蒸馏水，制成20%悬液，经1000r/min沉淀10分钟，吸取上清液分装安瓿或小管，储存于-60℃冰箱中，经用体重18～20g小白鼠做病毒滴定，符合要求后，方可作攻击毒用。
6.1.3疫苗参考对照品。
由检定所定期发给。
6.1.4待检疫苗
取同批安全试验合格疫苗用pH7.6PBS做5倍连续稀释，一般采用3个稀释度以上进行免疫，如1∶5、1∶25、1∶125的稀释度。
6.1.5免疫
选用体重12～14g的小白鼠，免疫时应同时有参考对照品的对照和攻击病毒LD50测定的对照小白鼠，参考对照品可做1∶25、1∶125和1∶625共3个稀释度进行免疫，每只小白鼠腹腔注射0.5ml，间隔一周再免疫一次，免疫时将疫苗保存在冰浴中，各组小白鼠都应在同样的条件下饲养。
6.1.6攻击
小白鼠于第一次免疫后14天，用预先测定含5～100个LD50的病毒量脑内攻击0.03ml/只。病毒测定用10-0、10-1、10-2、10-3，每稀释度不少于8只，疫苗免疫组小白鼠每个稀释度为14～16只，所有小白鼠自攻击之日起观察14天。第5天后死亡和呈现典型脑病症状也作为因狂犬病死亡而计算在内。
6.1.7判定结果和合格指标
要求原病毒悬液注射的小白鼠80%以上死亡，攻击病毒含量为5～100个LD50。液体浓缩疫苗合格指标应≥2.5IU/安瓿(2ml)，冻干浓缩疫苗应≥2.5IU/安瓿(1ml或2ml)。疫苗不合格可复试一次。
6.2 物理检查
液体浓缩疫苗应为橘红-紫红色混浊液体，久放形成可摇散的沉淀。冻干浓缩疫苗为淡黄色疏松体。
6.3 化学测定
按《生物制品化学检定规程》进行。
6.3.1 pH值
pH值应为7.2～8.0。
6.3.2氢氧化铝含量
不得超过0.7mg/ml。
6.3.3硫柳汞含量
不得超过0.01%。
6.3.4游离甲醛含量
不得超过0.015%。
6.3.5水分
冻干疫苗水分不得超过3.5%。
6.4 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
6.5 毒性试验
取疫苗接种11～13g小白鼠10只，每只腹腔注射0.5ml，观察7天，应健存。
6.6 稀释液
冻干浓缩疫苗用灭菌注射用水或其他适宜稀释液稀释，其质量应符合《中国药典》规定。
7 保存与效期
疫苗应保存于2～8℃。液体浓缩疫苗由效力合格之日起效期为1年，冻干浓缩疫苗由冻干之日起，效期为2年。