冻干流行性乙型脑炎活疫苗制造及检定规程
本品系将流行性乙型脑炎(下称乙脑)SA14-14-2减毒株病毒接种于原代地鼠肾单层细胞，经培育后收获病毒液，加保护剂冻干制成。用于预防乙脑。
1 毒种
1.1 毒种来源
乙脑SA14-14-2减毒株病毒。由中国药品生物制品检定所检定与分发。
该毒株经用乙脑敏感动物试验证明其嗜神经毒力减弱，经检查无外源因子存在，用乙脑特异性免疫血清做中和试验证实为乙脑病毒，并经免疫力试验证明具有免疫原性，经临床观察证明安全有效。
1.2 生产毒种批制备
毒种启封后，在地鼠肾单层细胞上增殖传递，传递代数不得超过3代。从原始毒种算起，总代数不是超过10代。在传代细胞病变明显时收获病毒液，经检定合格后为生产毒种批。
1.3 毒种检定
1.3.1 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
1.3.2 支原体检查
按《生物制品无菌试验规程》进行。
1.3.3 病毒滴定
抽样品做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6三个稀释度的病毒液，分别接种BHK21细胞，用蚀斑法进行滴定，病毒滴度≥7.2LogPFU/1.0ml为合格。冻干毒种批的滴度≥5.7LogPFU/1.0ml为合格。做病毒滴定同时应用参考苗进行滴定，以判断试验结果是否成立。
1.3.4 纯毒试验
生产毒种批与非同源性乙脑高价免疫血清混合，置37℃90分钟，接种地鼠肾单层细胞或BHK21细胞进行中和试验，观察5～7天判定结果。乙脑病毒完全被中和(无细胞病变或蚀斑出现)为合格，如仍有病变或蚀斑出现，应按上述方法再行中和。
1.3.5 脑内致病力试验
生产毒种批原液接种体重12～14g小白鼠10只，每只脑内注射0.03ml，接种后3天内死亡者不计，观察14天应活存。3天后如有小白鼠发病，应杀死取脑测定致病力，对小白鼠的脑内毒力不应超过3.0LogLD50/0.03ml，同时小白鼠皮下注射0.1ml10-1病鼠脑悬液进行皮下致病力试验，观察14天，应健存。
1.3.6 皮下感染人脑试验
生产毒种批原液接种体重10～12g小白鼠10只，每只皮下注射0.1ml，同时右侧脑内空刺，观察14天，应健存。
1.3.7 乳鼠传代返祖试验
生产毒种批原液接种3～5日龄乳鼠10只，每只脑内注射0.02ml。将发病的乳鼠杀死3只，解剖取脑测其致病力，用体重12～14g小白鼠测定，脑内毒力不应超过3.0LogLD50/0.03ml，同时皮下注射10只小白鼠，每只0.1ml10-1乳鼠脑悬液，观察14天，应健存。
1.3.8 外源因子检查
生产毒种批经非同源性乙脑高价免疫血清中和后，进行细胞培养试验。样品分别接种人二倍体细胞、BHK21细胞、原代地鼠肾细胞，于33～35℃进行培育，同时做对照培育。培育7、14天细胞应无病变，分别进行次代培育和血吸附试验；次代培育7、14天时亦分别观察细胞病变和进行血吸附试验。结果均无细胞病变并血吸附试验阴性为合格。
血吸附试验方法：观察到期的细胞，用0.2%～0.5%鸡、豚鼠红细胞混合液于4～8℃、20～25℃中依次进行血吸附检查。所用红细胞于2～8℃保存应不超过7天。
1.3.9 细胞基质外源因子检查
制备生产用种子批的细胞留取5%～10%不种毒，更换相应的维持液，置33～35℃培育。在培育7、14天时，镜下观察无细胞病变后分别做血吸附试验(方法同1.3.8项)。细胞无病变并血吸附试验阴性为合格。
1.4 生产毒种批保存
液体生产毒种批于-60℃保存不超过6个月可用于生产；冻干生产毒种批于-20℃以下保存2年内可用于生产。
2 疫苗制造
2.1 细胞制备
2.1.1 地鼠
选用10～14日龄健康地鼠，解剖取肾。如发现肾脏异常或有乳糜状腹水，应废弃。
2.1.2 疫苗生产过程中不得使用青毒素或其他β内酰胺类抗生素。
2.1.3 细胞消化及培养
解剖取出肾脏后剪成碎块，用适量的胰蛋白酶液消化，将分散后的细胞悬液种入培养瓶内，加入生长液，置36～37℃培养。细胞生长成致密单层即可接种病毒。
2.1.4 外源因子检查
每批细胞留取5%～10%不接种病毒，加入与生产相同维持液后置33～35℃培育14天。在培育7、14天时分别做血吸附试验(方法同1.3.8项)。在观察期内细胞无病变并血吸附试验阴性为合格。如细胞出现病变或血吸附试验阳性，由该批细胞制备的病毒原液应废弃。
2.2 病毒接种和培育
挑选长成致密单层的细胞，用洗液充分洗涤后加适量维持液，病毒接种量为2.7～3.7LogPFU/1.0ml，置35～36℃培育。
2.3 原液
2.3.1 收获病毒液
种毒后培育72小时以上，细胞出现明显病变时收获病毒液，澄清过滤后为原液。
2.3.2 原液检定
2.3.2.1 无菌试验
每瓶原液分别取样做无菌试验，样品种入硫乙醇酸盐、乙良马丁和肝斜面培养基，培养8天判定结果。
2.3.2.2 支原体检查
按《生物制品无菌试验规程》进行。
2.3.2.3 纯毒试验
每一消化批应抽样进行纯毒试验。方法同1.3.4项。
2.3.2.4 病毒滴定
方法同1.3.3项。滴度≥7.2LogPFU/1.0ml为合格。
2.4 疫苗半成品
2.4.1 疫苗混合
检定合格的原液合并后，加适宜保护剂。每批疫苗量应不超过15万ml。
2.4.2 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行
2.4.3 分装和冻干
疫苗应在冰浴下进行分装，采用适宜的冻干条件进行冻干。出柜后应在15℃以下进行封口。
3 成品检定
3.1 外观检查
冻干疫苗应为淡黄色疏松体。如稀释液后迅速溶解，溶解后应为橘红色透明液体，无异物。
3.2 残余水分含量
冻干疫苗残余水分应≤3.5%。
3.3pH值
冻干疫苗用蒸馏水复溶后，pH值应为7.2～8.0。
3.4 病毒滴定
方法同1.3.3项。病毒滴度≥5.7LogPFU/1.0ml为合格。
3.5 热稳定性试验
冻干疫苗置37℃7天后进行滴定(方法同1.3.3项)，滴度下降不应超过1.0LogPFU/ml。
3.6 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
3.7 安全试验
3.7.1 脑内致病力试验
方法及判定标准同1.3.5项。
3.7.2 皮下感染入脑试验
方法及判定标准同1.3.6项。
3.7.3 乳鼠传代返祖试验。
方法及判定标准同1.3.7项。
3.8 毒性试验
冻干疫苗每支加稀释液2.5ml溶解复原后，用体重12～15g小白鼠4只，每只腹腔注射0.5ml。注射后密切观察，30分钟内不应有异常反应，观察3天应健存。
3.9 残余牛血清蛋白含量
冻干疫苗每支加稀释液2.5ml溶解复原后，残余牛血清蛋白含量≤50ng/ml为合格。
4 疫苗稀释液
pH7.4～7.6灭菌磷酸盐缓冲生理盐水。每支安瓿2.5ml。
5 保存与效期
疫苗自冻干后病毒滴定合格之日起，在8℃以下保存效期为1年半，在-20℃保存效期为2年。
1 毒种
1.1 毒种来源
乙脑SA14-14-2减毒株病毒。由中国药品生物制品检定所检定与分发。
该毒株经用乙脑敏感动物试验证明其嗜神经毒力减弱，经检查无外源因子存在，用乙脑特异性免疫血清做中和试验证实为乙脑病毒，并经免疫力试验证明具有免疫原性，经临床观察证明安全有效。
1.2 生产毒种批制备
毒种启封后，在地鼠肾单层细胞上增殖传递，传递代数不得超过3代。从原始毒种算起，总代数不是超过10代。在传代细胞病变明显时收获病毒液，经检定合格后为生产毒种批。
1.3 毒种检定
1.3.1 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
1.3.2 支原体检查
按《生物制品无菌试验规程》进行。
1.3.3 病毒滴定
抽样品做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6三个稀释度的病毒液，分别接种BHK21细胞，用蚀斑法进行滴定，病毒滴度≥7.2LogPFU/1.0ml为合格。冻干毒种批的滴度≥5.7LogPFU/1.0ml为合格。做病毒滴定同时应用参考苗进行滴定，以判断试验结果是否成立。
1.3.4 纯毒试验
生产毒种批与非同源性乙脑高价免疫血清混合，置37℃90分钟，接种地鼠肾单层细胞或BHK21细胞进行中和试验，观察5～7天判定结果。乙脑病毒完全被中和(无细胞病变或蚀斑出现)为合格，如仍有病变或蚀斑出现，应按上述方法再行中和。
1.3.5 脑内致病力试验
生产毒种批原液接种体重12～14g小白鼠10只，每只脑内注射0.03ml，接种后3天内死亡者不计，观察14天应活存。3天后如有小白鼠发病，应杀死取脑测定致病力，对小白鼠的脑内毒力不应超过3.0LogLD50/0.03ml，同时小白鼠皮下注射0.1ml10-1病鼠脑悬液进行皮下致病力试验，观察14天，应健存。
1.3.6 皮下感染人脑试验
生产毒种批原液接种体重10～12g小白鼠10只，每只皮下注射0.1ml，同时右侧脑内空刺，观察14天，应健存。
1.3.7 乳鼠传代返祖试验
生产毒种批原液接种3～5日龄乳鼠10只，每只脑内注射0.02ml。将发病的乳鼠杀死3只，解剖取脑测其致病力，用体重12～14g小白鼠测定，脑内毒力不应超过3.0LogLD50/0.03ml，同时皮下注射10只小白鼠，每只0.1ml10-1乳鼠脑悬液，观察14天，应健存。
1.3.8 外源因子检查
生产毒种批经非同源性乙脑高价免疫血清中和后，进行细胞培养试验。样品分别接种人二倍体细胞、BHK21细胞、原代地鼠肾细胞，于33～35℃进行培育，同时做对照培育。培育7、14天细胞应无病变，分别进行次代培育和血吸附试验；次代培育7、14天时亦分别观察细胞病变和进行血吸附试验。结果均无细胞病变并血吸附试验阴性为合格。
血吸附试验方法：观察到期的细胞，用0.2%～0.5%鸡、豚鼠红细胞混合液于4～8℃、20～25℃中依次进行血吸附检查。所用红细胞于2～8℃保存应不超过7天。
1.3.9 细胞基质外源因子检查
制备生产用种子批的细胞留取5%～10%不种毒，更换相应的维持液，置33～35℃培育。在培育7、14天时，镜下观察无细胞病变后分别做血吸附试验(方法同1.3.8项)。细胞无病变并血吸附试验阴性为合格。
1.4 生产毒种批保存
液体生产毒种批于-60℃保存不超过6个月可用于生产；冻干生产毒种批于-20℃以下保存2年内可用于生产。
2 疫苗制造
2.1 细胞制备
2.1.1 地鼠
选用10～14日龄健康地鼠，解剖取肾。如发现肾脏异常或有乳糜状腹水，应废弃。
2.1.2 疫苗生产过程中不得使用青毒素或其他β内酰胺类抗生素。
2.1.3 细胞消化及培养
解剖取出肾脏后剪成碎块，用适量的胰蛋白酶液消化，将分散后的细胞悬液种入培养瓶内，加入生长液，置36～37℃培养。细胞生长成致密单层即可接种病毒。
2.1.4 外源因子检查
每批细胞留取5%～10%不接种病毒，加入与生产相同维持液后置33～35℃培育14天。在培育7、14天时分别做血吸附试验(方法同1.3.8项)。在观察期内细胞无病变并血吸附试验阴性为合格。如细胞出现病变或血吸附试验阳性，由该批细胞制备的病毒原液应废弃。
2.2 病毒接种和培育
挑选长成致密单层的细胞，用洗液充分洗涤后加适量维持液，病毒接种量为2.7～3.7LogPFU/1.0ml，置35～36℃培育。
2.3 原液
2.3.1 收获病毒液
种毒后培育72小时以上，细胞出现明显病变时收获病毒液，澄清过滤后为原液。
2.3.2 原液检定
2.3.2.1 无菌试验
每瓶原液分别取样做无菌试验，样品种入硫乙醇酸盐、乙良马丁和肝斜面培养基，培养8天判定结果。
2.3.2.2 支原体检查
按《生物制品无菌试验规程》进行。
2.3.2.3 纯毒试验
每一消化批应抽样进行纯毒试验。方法同1.3.4项。
2.3.2.4 病毒滴定
方法同1.3.3项。滴度≥7.2LogPFU/1.0ml为合格。
2.4 疫苗半成品
2.4.1 疫苗混合
检定合格的原液合并后，加适宜保护剂。每批疫苗量应不超过15万ml。
2.4.2 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行
2.4.3 分装和冻干
疫苗应在冰浴下进行分装，采用适宜的冻干条件进行冻干。出柜后应在15℃以下进行封口。
3 成品检定
3.1 外观检查
冻干疫苗应为淡黄色疏松体。如稀释液后迅速溶解，溶解后应为橘红色透明液体，无异物。
3.2 残余水分含量
冻干疫苗残余水分应≤3.5%。
3.3pH值
冻干疫苗用蒸馏水复溶后，pH值应为7.2～8.0。
3.4 病毒滴定
方法同1.3.3项。病毒滴度≥5.7LogPFU/1.0ml为合格。
3.5 热稳定性试验
冻干疫苗置37℃7天后进行滴定(方法同1.3.3项)，滴度下降不应超过1.0LogPFU/ml。
3.6 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
3.7 安全试验
3.7.1 脑内致病力试验
方法及判定标准同1.3.5项。
3.7.2 皮下感染入脑试验
方法及判定标准同1.3.6项。
3.7.3 乳鼠传代返祖试验。
方法及判定标准同1.3.7项。
3.8 毒性试验
冻干疫苗每支加稀释液2.5ml溶解复原后，用体重12～15g小白鼠4只，每只腹腔注射0.5ml。注射后密切观察，30分钟内不应有异常反应，观察3天应健存。
3.9 残余牛血清蛋白含量
冻干疫苗每支加稀释液2.5ml溶解复原后，残余牛血清蛋白含量≤50ng/ml为合格。
4 疫苗稀释液
pH7.4～7.6灭菌磷酸盐缓冲生理盐水。每支安瓿2.5ml。
5 保存与效期
疫苗自冻干后病毒滴定合格之日起，在8℃以下保存效期为1年半，在-20℃保存效期为2年。
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