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编号:16980
第一节 血清载脂蛋白定量的方法学及其参考值的评价
     一、载脂蛋白测定方法

    1.单向免疫扩散法(radialimmunodiffusion,RID)

    该法较简单,一般实验室均可进行。消耗较多的抗血清,扩散过程至少24h,最多需72h,测定下限值为10μg/ml。该方法虽然简单,应严格控制有关条件如:含抗血清的琼脂糖凝胶厚度要均匀;加入小孔的稀释抗原(血清)量要准确;含ApoB的脂蛋白如VLDL和LDL颗粒大小不一,如琼脂糖凝胶浓度在1.5%~2.0%,可能仅测出LDL的ApoB,大颗粒的LDL及VLDL的ApoB可能无法测出,因为难以穿过琼脂糖凝胶的孔隙。另外,扩散过程中,凝胶板一定要水平,否则易使扩散环呈椭圆形,难以准确测量直径。一般使沉淀环以3.5~10.0mm为宜,应在两个方向测量直径,其精度要求达到0.1mm。采用五种不同浓度参考值,测定沉淀环面积对相应浓度关系以曲线回归方程作图。

    2.电免疫测定法(electroimmunoassay,EIA)

    该法灵敏,抗血清用量少,如琼脂糖缓冲液中加入聚乙二醇及甘氨酸,其电泳时间可缩短一倍,火箭峰高以1~4cm为宜,火箭峰的测量可以计算面积或峰高,峰高从中心量起。测量精度最好能在0.1mm,灵敏度约2μg/ml,又称为火箭电泳法。

    3.免疫比浊法(immunoturbidimetryassay,ITA)

    简便快速,在自动分析仪进行操作并能批量检测,是目前临床使用最多的方法学。免疫比浊法有两种:一是测定光散射的,又名免疫散射比浊法(INA);需用特殊的激光浊度仪;另一种是利用光度计测定通过混浊溶液后的透光强度,称为透射免疫比浊法(ITA),其灵敏度低于INA。比浊法可以终点法和速率法测定,速率法是根据散射光强度与时间的关系,以微机处理计算出抗原抗体复合物形成的最大反应速度,后者与溶液中抗原量成正比,常可在1min内完成测定过程,可自动扣除空白;终点法比速率法稳定,一般多用终点法。

    4.酶联免疫法(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)

    该技术已广泛应用于极微量蛋白的定量测定,可测出ng级水平的抗原或抗体含量,该法可用于ApoE、C-Ⅱ、C-Ⅲ等含量较少的载脂蛋白的定量测定。

    5.放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)

    该法灵敏,抗血清用量少,所需设备较多,一般用125I标记抗原作为示踪物,除ApoC-Ⅰ(不含酪氨酸)以外,都可以作碘标记(氯胺T法),以双抗体法测定RIA法可检测最低至3~5ng。临床检验中不常用此法,主要用于动物实验的科学研究工作。

    还有荧光免疫法和化学发光法等灵敏度很高的方法。

    血清载脂蛋白测定的方法,从测定原理、方法学评价及参考值,刘秉文和李健斋等人作了大量的工作,为国内的载脂蛋白测定的临床应用奠定了基础。周新曾于1986年首先在国内研制成功抗人ApoB100血清,其后,国内同仁陆续研制出ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、E、CⅡ、CⅢ抗血清,并广泛应用于临床的疾病诊断,在部分大医院已成为常规检查项目。

    刘秉文在“脂蛋白与动脉粥样硬化“一书中全面总结了国内外载脂蛋白测定的方法学及其参考值,本节将引用如下比较表:

    表18-1 ApoAⅠ免疫测定法的比较

    RIA

    ELISA

    EIA

    RID

    INA

    ITA

    抗体

    P,M

    P,M

    P

    P,M

    P

    P

    灵敏度(n)

    0.3~10

    0.1~0.5

    100

    100

    150

    100

    测定范围(ng)

    1~200

    0.5~15

    100~500

    200~800

    200~500

    200~600

    批内CV(%)

    3~9

    4~8

    3~5

    6

    3~7

    1

    批间CV(%)

    5~10

    8~10

    3~9

    10

    6~7

    6

    正常值(g/L)

    1.0±0.2

    1.5±0.2

    1.2±0.2

    1.2±0.1

    1.2±0.2

    1.7±0.2

    P:多克隆抗体;M:单克隆抗体;RIA:放射免疫法;ELISA;酶联免疫法;RID:单向免疫扩散法;INA:免疫散射比浊法;ITA:免疫透射比浊法。

    (源自:刘秉文,1995.)

    表18-2 ApoAⅡ免疫测定法的比较

    RIA

    ELISA

    EIA

    RID

    INA

    ITA

    抗体

    P

    P,M

    P

    P

    P

    P

    灵敏度(g)

    0.5

    20

    5

    30

    20

    测定范围(ng)

    1~20

    5~50

    30~60

    50~400

    50~900

    40~150

    批内CV(%)

    7

    8

    5

    5

    5

    5

    批间CV(%)

    9

    7

    8

    -

    7

    6

    正常值(g/L)

    0.25±0.4

    0.35±0.05

    0.76±0.2

    0.29±0.02

    0.37±0.09

    0.36±0.03

    (源自:刘秉文,1995.)

    表18-3 ApoAⅣ免疫测定法的比较

    RIA

    ELISA

    EIA

    抗体

    P

    P

    P

    灵敏度(g)

    5

    0.2

    20

    测定范围(ng)

    5~50

    0.5~8

    50~200

    批内CV(%)

    5

    3.60

    5

    批间CV(%)

    7

    8

    9

    正常值(g/L)

    0.17±0.03

    0.14±0.05

    0.14±0.04

    (源自:刘秉文,1995.)

    表18-4 ApoB100免疫测定法的比较

    RIA

    ELISA

    EIA

    RID

    INA

    ITA

    抗体

    P,M

    P,M

    P

    P,M

    P

    P

    灵敏度(n)

    5~10

    2~20

    50~300

    300

    300

    300

    测定范围(ng)

    0~100

    2~10

    20~500

    50~600

    300~500

    100~500

    批内CV(%)

    4~8

    4~7

    1~7

    3~7

    4~7

    2

    批间CV(%)

    7~11

    10

    3~10

    6~7

    7~8

    2

    正常值(g/L)

    0.9±0.2

    0.85±0.1

    0.6±0.3

    0.8±0.2

    0.8±0.2

    0.8±0.3

    (源自:刘秉文,1995.)

    表18-5 ApoCⅠ免疫测定法的比较

    RIA

    ELISA

    INA

    抗体

    P

    P

    P

    灵敏度(n)

    1

    5

    50

    测定范围(ng)

    5~30

    15~100

    -

    批内CV(%)

    7

    3

    5

    批间CV(%)

    9

    5

    8

    正常值(g/L)

    0.05±0.03

    0.06±0.002

    0.06±0.01

    (源自:刘秉文,1995.)

    表18-6 ApoCⅡ免疫测定法的比较

    RIA

    ELISA

    EIA

    RID

    ITA

    抗体

    P

    P

    P

    P

    P

    灵敏度(g)

    10

    0.3

    45

    40

    10

    测定范围(ng)

    10~80

    0.5~5

    70~600

    40~600

    12~50

    批内CV(%)

    6

    3

    6.5

    2.1

    3.3

    批间CV(%)

    10

    8

    8.2

    3.9

    6.2

    正常值(g/L)

    0.04±0.01

    0.033±0.008

    0.04±0.002

    0.039±0.017

    0.04±0.01

    (源自:刘秉文,1995.)

    表18-7 ApoCⅢ免疫测定法的比较

    RIA

    ELISA

    EIA

    RID

    INA

    ITA

    抗体

    P

    P

    P

    P

    P

    P

    灵敏度(g)

    1

    0.3

    10

    76

    20

    15

    测定范围(ng)

    2~20

    1~6

    20~80

    76~600

    50~400

    30~120

    批内CV(%)

    13

    4.3

    8

    2.5

    6.3

    5.2

    批间CV(%)

    13

    4.3

    8

    3.5

    6.3

    5.2

    正常值(g/L)

    0.15±0.06

    0.16±0.03

    0.12±0.04

    0.127±0.037

    0.12±0.03

    0.11±0.03

    (源自:刘秉文,1995.)

    二、人血浆(清)载脂蛋白参考值比较

    刘秉文于1995年对国人血浆(清)各项载脂蛋白参考值与国外参考值作了详细的比较,其报道见表18-9、18-10、18-11、18-12、18-13、18-14、18-15。

    表18-8 ApoE免疫测定法的比较

    RIA

    ELISA

    EIA

    RID

    ITA

    抗体

    P

    P,M

    P

    P

    P

    灵敏度(n)

    0.2~8

    0.5

    20

    35

    5

    测定范围(ng)

    0.8~100

    0.5~6

    20~200

    50~300

    20~400

    批内CV(%)

    6

    4

    8

    5.9

    2

    批间CV(%)

    9

    8

    5

    7.2

    5

    正常值(g/L)

    0.05±0.02

    0.04±0.01

    0.10±0.04

    0.035±0.01

    0.04±0.01

    (源自:刘秉文,1995.)

    表18-9 国人血浆ApoAⅠ含量与国外报道的比较

    作者

    发表时间

    方法

    例数

    性别

    年龄

    均值±s(mg/dl)

    张祖辉

    1998

    RID

    307

    男

    20-77

    122.1±13.7

    刘秉文

    318

    女

    20-77

    125.5±15.9

    李键斋等

    1986

    EIA

    291

    男+女

    19-50

    119±17

    周新等*

    1990

    EIA

    692

    男

    13-85

    129.1±16.1

    477

    女

    18-80

    130.5±14.2

    Albers等

    1976

    RID

    20

    男+女

    11.5±7.3

    115.7±7.3

    Cheung等

    1977

    RID

    172

    男

    20-65

    120±20

    188

    女

    20-65

    135±25

    Reman等

    1978

    RID

    95

    男

    40-49

    137±23

    104

    女

    40-49

    137±23

    Schonfelcl等

    1974

    RIA

    41

    男

    13-58

    100±35

    34

    女

    16-58

    104±34

    Karlin等

    1976

    23

    男

    20-39

    130±3

    19

    女

    20-39

    154±6

    Avogaro等

    1978

    EIA

    60

    男

    20-60

    128±22

    60

    女

    20-60

    134±20

    Mordasini等

    1980

    EIA

    50

    男

    20-60

    113±9

    50

    女

    20-60

    125±17

    Miller等

    1980

    EIA

    8

    男

    34-70

    122±27

    8

    女

    52-68

    149±20

    Rosseneu等

    1981

    IAN

    12

    男

    29

    139±15

    14

    女

    30

    147±24

    Assmann等

    1982

    INA

    3032

    男

    20-65

    136±23

    1367

    女

    20-60

    146±25

    (源自:刘秉文,1995)

    *:作者补充。

    表18-10 国人血浆ApoAⅡ含量与国外报道的比较

    作者

    发表时间

    方法

    例数

    性别

    均值±s(mg/dl)

    罗静聪

    1988

    RID

    76

    男+女

    26.7±4.6

    刘秉文

    1988

    ELISA

    41

    男+女

    24.2±5.9

    胡维诚

    1987

    RID

    160

    男+女

    27.0±4.4

    Curry等

    1976

    RID

    19

    男

    78.0±1.7

    19

    女

    83.0±25

    Cheung等

    1977

    RID

    172

    男

    33.0±5

    188

    女

    36.0±6

    Assmann等

    1977

    EIA

    15

    男

    34.1±5

    15

    女

    38.3±5.5

    Schonfeld等

    1977

    RLA

    29

    男+女

    40.5±8.9

    Maupovic等

    1981

    ELA

    50

    男+女

    68.0±18

    Goldberg等

    1980

    RIA

    50

    男

    25.0±1

    50

    女

    26.0±1

    De Backnev等

    1982

    INA

    70

    男+女

    43.0±6.9

    Zech等

    1983

    RID

    27

    男+女

    24.0±0.6

    Noma等

    1983

    RLA

    27

    男+女

    32.0±8.3

    Nukita等

    1984

    EIA

    156

    男+女

    40.0±9

    (源自:刘秉文,1995)

    表18-11 国人血浆ApoB含量与国外报道的比较

    作 者

    发表时间

    方法

    例数

    性别

    均值±s(mg/dl)

    周新等

    1986

    EIA

    608

    男

    83.2±13.9

    511

    女

    80.4±13.4

    李健斋等

    1986

    EIA

    727

    男+女

    76±19

    吴兆丰、刘秉文

    1987

    RID

    304

    男

    87.9±14.4

    320

    女

    86.7±14.4

    Albers等

    1975

    RIA

    349

    男+女

    81.0±20

    Bantorich等

    1975

    RIA

    82

    男+女

    90.0±24

    Bedford等

    1976

    RIA

    128

    男+女

    87.0±30

    Schonfeld等

    1974

    RIA

    42

    男+女

    83.0±16

    Brussaard等

    1980

    EIA

    60

    男+女

    63±16

    Fruchart等

    1981

    EIA

    144

    男+女

    90

    Curry等

    1978

    EIA

    38

    男

    90±2.0

    36

    女

    88±11

    Curry等

    1978

    RID

    20

    男+女

    87±26

    Lees等

    1970

    RID

    64

    男+女

    83±25

    Snuderman等

    1975

    RID

    31

    男

    82±22

    Fievet等

    1979

    INA

    206

    男

    129±31

    271

    女

    120±34

    Heuck等

    1979

    INA

    68

    男+女

    82.0±23

    Rossenue等

    1981

    INA

    70

    男

    92±13

    Durrington等

    1976

    INA

    29

    男+女

    85±11

    (源自:刘秉文,1995)

    表18-12 国人血浆ApoCⅠ含量与国外报道的比较

    作 者

    发表时间

    方法

    例数

    性别

    均值±s(mg/dl)

    傅明德等

    1987

    ELISA

    202

    男

    7.6±2.5

    214

    女

    8.0±2.3

    Polz等

    1980

    RID

    10

    男+女

    6.9±2.0

    Curry等

    1981

    ELA

    68

    男+女

    6.0±1.5

    (源自:刘秉文,1995)

    表18-13 国人血浆ApoCⅡ含量与国外报道的比较

    作 者

    发表时间

    方法

    例数

    性别

    均值±s(mg/dl)

    傅明德等

    1987

    ELISA

    202

    男

    5.2±1.9

    241

    女

    4.9±1.8

    范萍等

    1989

    RID

    67

    男+女

    3.9±1.7

    Schonfeld等

    1979

    RIA

    93

    男+女

    3.9±1.4

    Curry等

    1981

    EIA

    68

    男+女

    4.0±2.0

    Kashyap等

    1977

    RIA

    32

    男+女

    5.0±0.4

    (源自:刘秉文,1995)

    表18-14 国人血清ApoCⅢ含量与国外报道的比较

    作者

    发表时间

    方法

    例数

    性别

    均值±s(mg/dl)

    傅明德等

    1988

    ELISA

    134

    男

    11.6±3.6

    135

    女

    12.0±3.7

    范萍等

    1989

    RID

    67

    男+女

    12.7±3.7

    刘秉文等

    1987

    IRA

    21

    男+女

    9.2±2.1

    Schonfeld等

    1979

    RID

    93

    男+女

    15.4±6.2

    Curry等

    1980

    ELA

    54

    男+女

    10.9±3.0

    Kashyap等

    1981

    RIA

    29

    男+女

    11.1±0.9

    (源自:刘秉文,1995)

    表18-15 国人血浆ApoE含量与国外报道的比较

    作者

    发表时间

    方法

    例数

    性别

    均值±s(mg/dl)

    刘铭锋、刘秉文等

    1987

    ELISA

    42

    男+女

    3.57±1.24

    刘铭锋、刘秉文等

    1987

    ELA

    50

    男+女

    4.70±1.18

    刘铭锋、刘秉文等

    1992

    RID

    116

    男

    3.95±0.98

    122

    女

    4.00±1.32

    张东升、夏辉明

    1991

    ELISA

    25

    男+女

    3.45±1.24

    Blum等

    1980

    RIA

    26

    男+女

    3.6±1.3

    Gregg等

    1984

    RIA

    12

    男+女

    4.8±1.2

    Wesgraber等

    1984

    RIA

    男+女

    5(3.5-7.0)

    (源自:刘秉文,1995)

    王抒、李健斋等于1996年报道283例血清各项载脂蛋白测定值及百分位数,如表18-16、18-17、18-18所示。这批数据是目前国内采用同一份标本检测脂质、脂蛋白和载脂蛋白项目最多的1次报道。除了作为参考值供临床应用外,并阐明了各项指标之间的相关性。笔者予以抄录,供参考。

    表18-16 血脂与脂蛋白水平(mmol/L)

    项目

    男(225例)

    女(58例)

    P值

    TC

    4.87±0.73

    5.16±0.84

    <0.05

    TG

    1.27±0.66

    1.25±0.71

    >0.05

    HDL-C

    1.41±0.35

    1.54±0.36

    <0.02

    HDL2-C

    0.56±0.17

    0.63±0.19

    <0.02

    HDL3-C

    0.86±0.23

    0.91±0.19

    >0.05

    LDL-C

    2.95±0.68

    3.13±0.12

    >0.05

    (源自:王抒,1996)

    表18-17 几项常用比值*

    项 目

    男

    女

    LDL-C/HDL-C

    2.21±0.72

    2.16±0.80

    HDL2-C/HDL3-C

    0.66±0.12

    0.69±0.15

    ApoB/ApoAⅠ

    0.72±0.16

    0.74±0.17

    ApoAⅠ/ApoAⅡ

    4.10±0.65

    4.10±0.68

    ApocⅡ/ ApoCⅢ

    0.39±0.12

    0.41±0.16

    男女组间无显著意义

    (源自:王抒,1996)

    表18-18 各项载脂蛋白测定值与百分位数

    项目

    X±S

    p5

    p25

    p50

    p75

    p95

    男(225例)

    ApoAⅠ(g/L)

    1.42±0.17

    1.17

    1.30

    1.43

    1.51

    1.72

    ApoAⅡ(g/L)

    0.36±0.66

    0.28

    0.32

    0.35

    0.40

    0.46

    ApoB(g/L)

    1.01±0.21

    0.72

    0.86

    1.00

    1.14

    1.38

    ApoCⅠ(mg/L)

    53±17

    31

    43

    50

    60

    83

    ApoCⅡ(mg/L)

    34±16

    13

    24

    31

    42

    69

    ApoCⅢ(mg/L)

    44±17

    26

    34

    41

    51

    74

    ApoE(mg/L)

    44±17

    26

    34

    41

    51

    74

    Lp(α)(mg/L)

    144125

    26

    53

    107

    185

    382

    女(58例)

    ApoAⅠ(g/L)

    1.45±0.14

    1.21

    1.34

    1.44

    1.55

    1.74

    ApoAⅡ(g/L)

    0.36±0.06

    0.26

    0.33

    0.36

    0.39

    0.44

    ApoB(g/L)

    1.07±0.23

    0.71

    0.90

    1.08

    1.20

    1.49

    ApoC(mg/L)

    53±18

    30

    39

    51

    61

    92

    ApoCⅡ(mg/L)

    41±18

    20

    28

    38

    49

    77

    ApoCⅢ(mg/L)

    104±40

    52

    72

    100

    129

    184

    ApoE(mg/L)

    51±18

    33

    37

    48

    58

    89

    Lp(α)(mg/L)

    154±116

    35

    66

    117

    207

    464

    国内的已有报道表明,人血清载脂蛋白参考值水平尚有一定的差异。引起这种差异的原因是多方面的,目前认为主要原因有:①检测方法与仪器不同;②试剂质量尤其是抗血清技术标准不统一;③国内尚未采用完全符合国际标准的定值血清;④人群的生活习惯及种族差异。为此对于国人的血清载脂蛋白参考值的确立,尚需付出艰辛的劳动。