第三节 蛋白质浓度的测定
一、双缩脲法
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，至令仍广泛采用。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期价段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
二、Lowry法
此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂(福林-酚试剂)，结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。
三、紫外吸收法
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：
是蛋白质溶液在280nm波长处(光程1厘米)测得的光密度值。
是蛋白质溶液在260nm小波长处(光程1厘米)处所测得的光密度值。此方程是从烯醇酶(在酵母核酸存在时)得出来的。因此，对其他蛋白质和其他核酸不一定适用。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因此，浓度为0.1%的各种蛋白质在280nm处的消光系数(
)在0.5～2.5之间变化。所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收。例如，牛血清白蛋白的α0.1%在225nm和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为0.58。在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在，因此，此值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10μl/ml～100μl/ml的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到：
光密度之差求得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。但是，蛋白质之间的分子量差异比较大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因pH改变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。
(吴翠华 贺小玲 周新)