荚膜多糖抗原分子大小测定（琼聚糖4B柱层析法）
1 试剂
1.1 琼聚糖4B凝胶。
1.20.2mol /L 氯化钠溶液，pH7.0洗脱液。
1.3 蓝色葡聚糖2000(2～4mg)加维生素B12(0.2mg)，加蒸馏水1ml溶解。
2 仪器
2.1 层析柱(1.5～1.6×100cm)。
2.2 206nm波长紫外监测仪。
2.3 部分收集器及试管。
2.4 凝胶和洗脱液储瓶，适宜的控制装置和记录器。
3 操作
3.1 琼聚糖4B凝胶的漂洗
取琼聚糖4B凝胶约300ml，加0.2mol /L 氯化钠溶液500ml，充分搅拌，静置1～2小时，倾去上层液体和悬浮于其中的细小颗粒，重复上述操作数次后至上层液体无细小颗粒，置真空罐内，抽去凝胶中的空气。
3.2 装柱
将洗好的琼聚糖4B凝胶慢慢注入柱中，避免夹杂气泡，装至约90cm，调整流速为10～12ml /小时，流洗2天。
3.3 标定
空流体积(Vo)及柱床总体积(Vi)
取蓝色葡聚糖及维生素B12溶液1ml，加于已平衡的柱上，以0.2mol /L 氯化钠溶液流洗，用部分收集器收集各组分，流速为10～12ml /小时，每管2～4ml，同时于206nm波长下自动监测，记录流洗液图谱。第一峰为蓝色葡聚糖峰，计算由加样起至第一峰峰顶的流洗液体积，即为Vo。第二峰为维生素B12峰，计算由加样起至第二峰峰顶的流洗液体积，即为Vi。
3.4 多糖抗原Kd值的测定
3.4.1 取约1ml样品(含多糖抗原3～5mg，冻干样品可用1.2项溶液溶解)。加于已标定的琼聚糖4B胶柱上，用0.2mol /L 氯化钠溶液流洗，流洗液用量为柱床总体积的1.5倍，每管收集2～4ml，同时于206nm波长下自动监测，记录流洗液图谱，由加样起至多糖峰峰顶流洗体积为Ve，计算分配系数(Kd)。
Kd=Ve―Vo/Vi―Vo
3.4.2Kd≤0.5多糖抗原回收率的计算
用求积仪分别计算Kd值0.5以前组分峰的面积除以所有组分峰的面积，即得Kd≤0.5多糖抗原回收率。
Kd≤0.5多糖回收率(%)=Kd0.5以前组分峰的面积/所有组分峰的总面积×100
注意：过柱操作在10～20℃下进行。
1.1 琼聚糖4B凝胶。
1.20.2mol /L 氯化钠溶液，pH7.0洗脱液。
1.3 蓝色葡聚糖2000(2～4mg)加维生素B12(0.2mg)，加蒸馏水1ml溶解。
2 仪器
2.1 层析柱(1.5～1.6×100cm)。
2.2 206nm波长紫外监测仪。
2.3 部分收集器及试管。
2.4 凝胶和洗脱液储瓶，适宜的控制装置和记录器。
3 操作
3.1 琼聚糖4B凝胶的漂洗
取琼聚糖4B凝胶约300ml，加0.2mol /L 氯化钠溶液500ml，充分搅拌，静置1～2小时，倾去上层液体和悬浮于其中的细小颗粒，重复上述操作数次后至上层液体无细小颗粒，置真空罐内，抽去凝胶中的空气。
3.2 装柱
将洗好的琼聚糖4B凝胶慢慢注入柱中，避免夹杂气泡，装至约90cm，调整流速为10～12ml /小时，流洗2天。
3.3 标定
空流体积(Vo)及柱床总体积(Vi)
取蓝色葡聚糖及维生素B12溶液1ml，加于已平衡的柱上，以0.2mol /L 氯化钠溶液流洗，用部分收集器收集各组分，流速为10～12ml /小时，每管2～4ml，同时于206nm波长下自动监测，记录流洗液图谱。第一峰为蓝色葡聚糖峰，计算由加样起至第一峰峰顶的流洗液体积，即为Vo。第二峰为维生素B12峰，计算由加样起至第二峰峰顶的流洗液体积，即为Vi。
3.4 多糖抗原Kd值的测定
3.4.1 取约1ml样品(含多糖抗原3～5mg，冻干样品可用1.2项溶液溶解)。加于已标定的琼聚糖4B胶柱上，用0.2mol /L 氯化钠溶液流洗，流洗液用量为柱床总体积的1.5倍，每管收集2～4ml，同时于206nm波长下自动监测，记录流洗液图谱，由加样起至多糖峰峰顶流洗体积为Ve，计算分配系数(Kd)。
Kd=Ve―Vo/Vi―Vo
3.4.2Kd≤0.5多糖抗原回收率的计算
用求积仪分别计算Kd值0.5以前组分峰的面积除以所有组分峰的面积，即得Kd≤0.5多糖抗原回收率。
Kd≤0.5多糖回收率(%)=Kd0.5以前组分峰的面积/所有组分峰的总面积×100
注意：过柱操作在10～20℃下进行。