精制抗毒素制造及检定规程
本规程适用于白喉、破伤风、气性坏疽及肉毒四种精制抗毒素。
精制白喉、破伤风、气性坏疽、肉毒抗毒素系分别由各该抗毒素的马血浆经胃酶消化后用硫酸铵盐析法制得的液体或冻干抗毒素球蛋白制剂。分别用于各该疾病的预防和治疗。
1 制造
1.1对血浆的要求
1.1.1制造精制抗毒素的血浆，应符合附录1《抗毒素生产用马匹免疫方法》的规定。在保存期间如发一周明显的溶血、染菌及其他异常现象，不得投入生产。
1.1.2血浆的抗毒素效价不得低于下列要求：
血浆种类每瓶血浆效价(IU/ml)
白喉1000
破伤风1000
威氏250
脓毒300
水肿550
溶组织550
A型肉毒1000
B型肉毒600
E型肉毒600
以上效价均以动物测定方法为准。
1.2制造程序
1.2.1消化
1.2.1.1第1法
血浆用2～4倍水稀释，调节pH至3.2～3.6，加入胃酶适量及甲苯0.2%～0.4%(ml/ml)，于29～31℃消化1～1.5小时。
1.2.1.2第2法
血浆用2～4倍水稀释，调节pH至3.6～4.0，加入胃酶适量及甲苯0.2%～0.4%(ml/ml)，于22±℃消化20～22小时。
1.2.2第1次沉淀及加热处理。
每100ml消化液加硫酸铵14～16g，白喉及破伤风抗毒素调节pH至4.8～5.6，气性坏疽及肉毒抗毒素调节pH至4.5～5.0；白喉、破伤风、气性坏疽抗毒素加温至57～57℃，肉毒抗毒素加温至50～52℃，均保持30分钟。加温终了，尽速降温至45℃以下，分离，取清液。
1.2.3第2次沉淀
上述清液调节pH至7.0～7.4，每100ml加硫酸铵19～21g，分离，取沉淀，压干。
上述沉淀用水稀释至蛋白含量不超过2%(g/ml)，加明矾不少于0.8%(g/ml)，调节pH至7.7～7.9，分离，取清液。
1.2.5浓缩
1.2.5.1第1法
将上述清液第100ml加硫酸铵38g，分离，取沉淀，压干。沉淀物透析至硫酸铵含量0.1%(g/ml)以下。
1.2.5.2第2法
将上述清液混合，通过超滤装置进行超滤，浓缩至硫酸铵含量为0.1%(g/ml)以下。
1.2.6最后处理
上述透析后的血清进行下列处理：
1.2.6.1调整固体总量不超过20%(g/ml)。蛋白含量不超过17%(g/ml)。
1.2.6.2加氯化钠使最终含量为0.9%(g/ml)。
1.2.6.3加三氯甲烷使最终含量为0.5%(ml/ml)或硫柳汞液使最终含量为0.01%(g/ml)为防腐剂。用于制造冻干抗毒素者只用三氯甲烷为防腐剂。
1.2.6.4调节pH至6.0～7.0。
1.2.6.5除菌过滤，并做无菌试验。
1.2.7冻干
经除菌过滤及半成品检定合格的精制抗毒素，可用冻干法制成干燥制品。
1.3对制造工艺的要求及规定
1.3.1制造室内部装修材料应便于清洁消毒，地面耐腐蚀，室内尽可能低温，力争做到无菌操作。
1.3.2所用仪表和量具应精密准确，并经常校正。一切与血浆接触的器皿、用具等，应注意不染有热原质，不含有毒物物质。消化液加热处理前后的器皿、用具须严格处理。未经处理的器皿、用具不得用于不同批。
1.3.3所用化学原料的规格应不低于化学纯(三级纯)或符合《中国生物制品主要原材料试行标准》规定。胃酶应力求活力高，粘液素含量少，类A血型物质含量低，并经过活力单位及类A血型物质含量测定。制造用水，应采取有效措施防止污染或产生热原质。
1.3.4抗毒素精制的每步操作均应尽量除净非抗毒素蛋白质，以提高制品纯度。
1.3.5制造过程中加酸、碱及硫酸铵等时，速度不宜过快，避免局部浓度过高；酸、碱原液尝试不宜超过2mol/L。操作时应尽量避免产生大量泡沫。应采取有效措施防止染菌和产生热原质。除必要的操作时间外，应尽量缩短生产周期。
1.3.6制造过程中必须严格执行《生物制品分批规程》，不得将中间回收品并入不同批内。制造批号不同但制造方法与所含防腐剂相同并经检定(无菌试验、安全试验、热原质试验)合格的半成品可进行合并，但合并批数不得超过2批。多价制品，其各单价半成品合并时，亦应符合上述原则。
1.3.7关于精制抗毒素再制的规定
1.3.7.1凡属下列范围的半成品及成品，可予再制。
(1)热原质试验结果阳性者。
(2)非肉眼可见而通过无菌试验发现的染菌，经过滤不能除菌者。
(3)理化检定不合格者。
(4)成品装量不足者。
(5)超过效期的库存制品。
(6)种类及制造方法相同，批号及数量清楚的分装检损品及滤器冲洗液可合并再制(但该批再制品的分装检损品应予废弃)。
1.3.7.2再制方法可根据具体情况制定，但制成后的质量必须符合检定要求。
1.3.8多价气性坏疽抗毒素按下列单位比例进行混合。
威氏：水肿：脓毒=2∶2∶1。
必要时可加入1份溶组织抗毒素。
1.3.9制成之精制抗毒素，须在冷暗处保存至少1个月作为稳定期。
1.4半成品检定
由制造部门进行理化检定、无菌试验、安全试验、热原质试验、类A血型物质测定及效价测定。效价测定、类A血型物质测定及热原质试验可与质量检定部门会同进行。检定方法及要求同成品检定。
2 成品检定
由质量检定部门进行全面检定，半成品已会同检定的项目可抽检。
2.1鉴别试验
每批成品至少抽取一瓶作以下鉴别试验：
2.1.1作动物中和试验(同效价测定)或免疫扩散试验，以验证本品系瓶签标示的抗毒素。
2.1.2用兔抗马血浆的兔Igg 与本品作免疫扩散试验，以验证本品为马血清蛋白成分(如同一制造室无其他动物免疫血清生产，本试验可免做)。
2.2理化检定
2.2.1外观
液体精制抗毒素应为几乎无色或淡黄色的澄明液体，不得含有渣粒或异物，长期贮存后可有微量能摇散的沉淀产生。除血清本身及防腐剂的特有气味外，不得有其他气味。冻干精制抗毒素应为白色或微带粉红色的疏松体，加入规定量蒸馏水后轻轻摇动，应于15分钟内完全溶解。溶解后的外观应与液体精制抗毒素相同。
2.2.2固体总量及蛋白含量
液体精制抗毒素以及冻干制品的安规定量溶解后，固体总量不得超过20%(g/ml)。蛋白含量不得超过17%(g/ml)。
2.2.3pH值应为6.0～7.0。
2.2.4氯化钠含量应为0.85%～0.95%(g/ml)。
2.2.5硫酸铵含量
液体精制抗毒素以及冻干制品按规定量溶解后，均不得超过0.1%(g/ml)。
2.2.6液体精制抗毒素的防腐剂，用三氯甲烷者不得超过0.5%(mlg/ml)，用硫柳汞者不得超过0.01%(g/ml)。
2.2.7冻干精制抗毒素水分含量不得超过3%。
2.2.8电泳检查
将样品稀释至2%蛋白浓度，做琼脂糖电泳分析，应不含或仅含痕量白蛋白迁移率的蛋白。
2.2.9F(ab)2含量
用SDS-PAGE法(见《生物制品化学检定规程》)测定，预防用抗毒素的F(ab)2含量不得低于50%，治疗用抗毒素的F(ab)2含量不得低于60%。
2.3无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
2.4安全试验
取体重300～400g豚鼠2只，每只皮下注射精制抗毒素5ml，于第3至5日观察局部，除轻度红肿外，应无脓肿及坏死；第7日局部反应应消失，且体重不轻于注射前，如体重有轻微下降，可继续观察3日，如体重上升且高于注射前，可判为合格。
2.5热原质试验
按《生物制品热原质试验规程》进行，注射剂量为3ml/kg。判定标准按该4.1项要求进行。
2.6类A血型物质含量。
用血凝抑制法(附录6)测定，类A血型物质不得超过4μg/ml。
2.7效价测定
2.7.1效价测定用标准抗毒素及试验毒素由中国药品生物制品检定所统一定期分发。
2.7.2各种抗毒素的效价测定分别按附录2～5进行。
2.7.3对各种抗毒素成品(冻干制品系按规定溶解后)的最低效价要求如下：
抗毒素种类IU/ml IU/gp
白喉预防用：2000 30000
治疗用：3000 40000
破伤风预防用：2000 35000
治疗用：3000 45000
气性坏疽(多价)1000
气性坏疽(威氏)1000 8000
气性坏疽(脓毒)1500 12500
气性坏疽(水肿)2500 20000
气性坏疽(溶组织)2500 20000
A型肉毒3000 20000
B型肉毒3000 20000
E型肉毒3000 20000
3 保存
应保存在2～8℃冷暗干燥处。
4 效期
自效价测定合格之日起，精制抗毒素装20%(不得低于16%)超量者，液体制品效期为5年，冻干制品效期为7年；装10%(不得低于8%)超量者，液体制品效期为3年，冻干制品效期为5年。
精制白喉、破伤风、气性坏疽、肉毒抗毒素系分别由各该抗毒素的马血浆经胃酶消化后用硫酸铵盐析法制得的液体或冻干抗毒素球蛋白制剂。分别用于各该疾病的预防和治疗。
1 制造
1.1对血浆的要求
1.1.1制造精制抗毒素的血浆，应符合附录1《抗毒素生产用马匹免疫方法》的规定。在保存期间如发一周明显的溶血、染菌及其他异常现象，不得投入生产。
1.1.2血浆的抗毒素效价不得低于下列要求：
血浆种类每瓶血浆效价(IU/ml)
白喉1000
破伤风1000
威氏250
脓毒300
水肿550
溶组织550
A型肉毒1000
B型肉毒600
E型肉毒600
以上效价均以动物测定方法为准。
1.2制造程序
1.2.1消化
1.2.1.1第1法
血浆用2～4倍水稀释，调节pH至3.2～3.6，加入胃酶适量及甲苯0.2%～0.4%(ml/ml)，于29～31℃消化1～1.5小时。
1.2.1.2第2法
血浆用2～4倍水稀释，调节pH至3.6～4.0，加入胃酶适量及甲苯0.2%～0.4%(ml/ml)，于22±℃消化20～22小时。
1.2.2第1次沉淀及加热处理。
每100ml消化液加硫酸铵14～16g，白喉及破伤风抗毒素调节pH至4.8～5.6，气性坏疽及肉毒抗毒素调节pH至4.5～5.0；白喉、破伤风、气性坏疽抗毒素加温至57～57℃，肉毒抗毒素加温至50～52℃，均保持30分钟。加温终了，尽速降温至45℃以下，分离，取清液。
1.2.3第2次沉淀
上述清液调节pH至7.0～7.4，每100ml加硫酸铵19～21g，分离，取沉淀，压干。
上述沉淀用水稀释至蛋白含量不超过2%(g/ml)，加明矾不少于0.8%(g/ml)，调节pH至7.7～7.9，分离，取清液。
1.2.5浓缩
1.2.5.1第1法
将上述清液第100ml加硫酸铵38g，分离，取沉淀，压干。沉淀物透析至硫酸铵含量0.1%(g/ml)以下。
1.2.5.2第2法
将上述清液混合，通过超滤装置进行超滤，浓缩至硫酸铵含量为0.1%(g/ml)以下。
1.2.6最后处理
上述透析后的血清进行下列处理：
1.2.6.1调整固体总量不超过20%(g/ml)。蛋白含量不超过17%(g/ml)。
1.2.6.2加氯化钠使最终含量为0.9%(g/ml)。
1.2.6.3加三氯甲烷使最终含量为0.5%(ml/ml)或硫柳汞液使最终含量为0.01%(g/ml)为防腐剂。用于制造冻干抗毒素者只用三氯甲烷为防腐剂。
1.2.6.4调节pH至6.0～7.0。
1.2.6.5除菌过滤，并做无菌试验。
1.2.7冻干
经除菌过滤及半成品检定合格的精制抗毒素，可用冻干法制成干燥制品。
1.3对制造工艺的要求及规定
1.3.1制造室内部装修材料应便于清洁消毒，地面耐腐蚀，室内尽可能低温，力争做到无菌操作。
1.3.2所用仪表和量具应精密准确，并经常校正。一切与血浆接触的器皿、用具等，应注意不染有热原质，不含有毒物物质。消化液加热处理前后的器皿、用具须严格处理。未经处理的器皿、用具不得用于不同批。
1.3.3所用化学原料的规格应不低于化学纯(三级纯)或符合《中国生物制品主要原材料试行标准》规定。胃酶应力求活力高，粘液素含量少，类A血型物质含量低，并经过活力单位及类A血型物质含量测定。制造用水，应采取有效措施防止污染或产生热原质。
1.3.4抗毒素精制的每步操作均应尽量除净非抗毒素蛋白质，以提高制品纯度。
1.3.5制造过程中加酸、碱及硫酸铵等时，速度不宜过快，避免局部浓度过高；酸、碱原液尝试不宜超过2mol/L。操作时应尽量避免产生大量泡沫。应采取有效措施防止染菌和产生热原质。除必要的操作时间外，应尽量缩短生产周期。
1.3.6制造过程中必须严格执行《生物制品分批规程》，不得将中间回收品并入不同批内。制造批号不同但制造方法与所含防腐剂相同并经检定(无菌试验、安全试验、热原质试验)合格的半成品可进行合并，但合并批数不得超过2批。多价制品，其各单价半成品合并时，亦应符合上述原则。
1.3.7关于精制抗毒素再制的规定
1.3.7.1凡属下列范围的半成品及成品，可予再制。
(1)热原质试验结果阳性者。
(2)非肉眼可见而通过无菌试验发现的染菌，经过滤不能除菌者。
(3)理化检定不合格者。
(4)成品装量不足者。
(5)超过效期的库存制品。
(6)种类及制造方法相同，批号及数量清楚的分装检损品及滤器冲洗液可合并再制(但该批再制品的分装检损品应予废弃)。
1.3.7.2再制方法可根据具体情况制定，但制成后的质量必须符合检定要求。
1.3.8多价气性坏疽抗毒素按下列单位比例进行混合。
威氏：水肿：脓毒=2∶2∶1。
必要时可加入1份溶组织抗毒素。
1.3.9制成之精制抗毒素，须在冷暗处保存至少1个月作为稳定期。
1.4半成品检定
由制造部门进行理化检定、无菌试验、安全试验、热原质试验、类A血型物质测定及效价测定。效价测定、类A血型物质测定及热原质试验可与质量检定部门会同进行。检定方法及要求同成品检定。
2 成品检定
由质量检定部门进行全面检定，半成品已会同检定的项目可抽检。
2.1鉴别试验
每批成品至少抽取一瓶作以下鉴别试验：
2.1.1作动物中和试验(同效价测定)或免疫扩散试验，以验证本品系瓶签标示的抗毒素。
2.1.2用兔抗马血浆的兔Igg 与本品作免疫扩散试验，以验证本品为马血清蛋白成分(如同一制造室无其他动物免疫血清生产，本试验可免做)。
2.2理化检定
2.2.1外观
液体精制抗毒素应为几乎无色或淡黄色的澄明液体，不得含有渣粒或异物，长期贮存后可有微量能摇散的沉淀产生。除血清本身及防腐剂的特有气味外，不得有其他气味。冻干精制抗毒素应为白色或微带粉红色的疏松体，加入规定量蒸馏水后轻轻摇动，应于15分钟内完全溶解。溶解后的外观应与液体精制抗毒素相同。
2.2.2固体总量及蛋白含量
液体精制抗毒素以及冻干制品的安规定量溶解后，固体总量不得超过20%(g/ml)。蛋白含量不得超过17%(g/ml)。
2.2.3pH值应为6.0～7.0。
2.2.4氯化钠含量应为0.85%～0.95%(g/ml)。
2.2.5硫酸铵含量
液体精制抗毒素以及冻干制品按规定量溶解后，均不得超过0.1%(g/ml)。
2.2.6液体精制抗毒素的防腐剂，用三氯甲烷者不得超过0.5%(mlg/ml)，用硫柳汞者不得超过0.01%(g/ml)。
2.2.7冻干精制抗毒素水分含量不得超过3%。
2.2.8电泳检查
将样品稀释至2%蛋白浓度，做琼脂糖电泳分析，应不含或仅含痕量白蛋白迁移率的蛋白。
2.2.9F(ab)2含量
用SDS-PAGE法(见《生物制品化学检定规程》)测定，预防用抗毒素的F(ab)2含量不得低于50%，治疗用抗毒素的F(ab)2含量不得低于60%。
2.3无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
2.4安全试验
取体重300～400g豚鼠2只，每只皮下注射精制抗毒素5ml，于第3至5日观察局部，除轻度红肿外，应无脓肿及坏死；第7日局部反应应消失，且体重不轻于注射前，如体重有轻微下降，可继续观察3日，如体重上升且高于注射前，可判为合格。
2.5热原质试验
按《生物制品热原质试验规程》进行，注射剂量为3ml/kg。判定标准按该4.1项要求进行。
2.6类A血型物质含量。
用血凝抑制法(附录6)测定，类A血型物质不得超过4μg/ml。
2.7效价测定
2.7.1效价测定用标准抗毒素及试验毒素由中国药品生物制品检定所统一定期分发。
2.7.2各种抗毒素的效价测定分别按附录2～5进行。
2.7.3对各种抗毒素成品(冻干制品系按规定溶解后)的最低效价要求如下：
抗毒素种类IU/ml IU/gp
白喉预防用：2000 30000
治疗用：3000 40000
破伤风预防用：2000 35000
治疗用：3000 45000
气性坏疽(多价)1000
气性坏疽(威氏)1000 8000
气性坏疽(脓毒)1500 12500
气性坏疽(水肿)2500 20000
气性坏疽(溶组织)2500 20000
A型肉毒3000 20000
B型肉毒3000 20000
E型肉毒3000 20000
3 保存
应保存在2～8℃冷暗干燥处。
4 效期
自效价测定合格之日起，精制抗毒素装20%(不得低于16%)超量者，液体制品效期为5年，冻干制品效期为7年；装10%(不得低于8%)超量者，液体制品效期为3年，冻干制品效期为5年。
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