血源乙型肝炎疫苗制造及检定规程
本品系由无症状HBsAg携带者血浆提取的HBsAg，经纯化、灭活及加佐剂吸附后制成。用于预防乙型肝炎。
1 血源
1.1 对献血员的要求
1.1.1 献血员应为20～50岁无症状HBsAg携带者，其肝功能应无显着异常，并稳定。对献血员的其他要求按《原料血浆采集(单采血浆术)规程》执行。
1.1.2个月接种过活疫苗，1年内接种过狂犬病疫苗者，均不采血。
1.1.3 必要时以免疫扩散法(ID)测定HBsAg亚型。血源应以ad亚型为主，可有少量ay亚型。
1.2 单份血浆检查
1.2.1 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
1.2.2HbsAg测定
用对流电泳法测定，HBsAg滴度应≥1∶8，或用反向血凝法(RPHA)测定，滴度应≥1∶1024。
1.3 混合血浆检查
1.3.1支原体检查
按《生物制品无菌试验规程》进行。
1.3.2 取样接种孔雀绿培养基，35～37℃培养28天，结果应为阴性。
1.3.3 外源病毒检查
用Vero细胞和人二倍体细胞各3瓶，每瓶容量为10～15ml，各接种0.2ml样品，35～37℃培养10天，应无病变出现。用0.2%～0.5%鸡与豚鼠红细胞等量混合后于37℃吸附1小时，测定血吸附反应，应均为阴性。
2 抗原的浓缩和变化
2.1 血浆脱纤维
于血浆中加入氯化钙溶液，使之脱纤维。
2.2硫酸铵沉淀
于血清中加入硫酸铵饱和溶液，或用固体硫酸铵，使最后达到适宜的饱和度，沉淀HBsA.
2.3 超离心纯化
溴化钾等密度区带离心2～3次，每次离心后分部收样，根据紫外监测峰及密度测定，合并合格的样品，经超滤去盐浓缩。蔗糖速率区带离心1～2次，分离出HBsAg。
3 灭活
3.1 胃酶处理
将HBsAg悬液加入适量胃酶，置35～37℃处理4～5小时，最后超滤去胃酶。
3.2 尿素处理
于HBsAg悬液中加尿素至4～8mol/L置37℃处理4～5小时，超滤去尿素。亦可不用尿素处理。
3.3福尔马林灭活
于HBsAg悬液中按1∶4000加入福尔马林，置37℃72～96小时。不用尿素处理者可用1∶2000福尔马林灭活。
4 稀释与吸附
已灭活的疫苗原液经除菌过滤后，根据Lowry法检测折算的特异性蛋白含量进行稀释，加入A1(OH)3吸附，并于疫苗内加入防腐剂。
5 半成品检定
5.1 总蛋白含量测定
用Lowry法测定，使用检定所提供的标准品。
5.2HBsAg含量测定
按总蛋白含量将样品稀释至不同稀释度，用RIA或火箭电泳法测定，使用检定所提供的标准品，HBsAg含量应在90%以上。
5.3 电镜检查
取每台离心机每次蔗糖离心后的样品，制作5个铜网，在60000倍电镜下，每个铜网观察6个视野，结果应主要为22nm球形颗粒，未见Dane颗粒为合格。有可疑Dane颗粒者应以加倍视野数检查。
5.4 残留杂蛋白检查
5.4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳法
浓缩胶浓度为4%，分离胶为7.5%，加10μgHBsAg样品和适量的人血清白蛋白进行电泳，银染，试验样品应不出现明显杂蛋白带。
5.4.2SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法
HBsAg样品经SDS处理后在7.0%浓缩胶和15%分离胶中加入5μg进行电泳，结果在分离胶中应主要存在22000及28000分子量带，应不出现明显的杂蛋白带。
5.5HBV DNA检查
用HBv DNA片段制备探针，取200μg除菌后的样品与探针进行杂交，结果应为阴性。控针的灵敏度应≤1pg。
5.6 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
6 分装
每支安瓿分装1.0ml，HBsAg含量分别为10μg和30μg两种规程。
7 成品检定
7.1 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
7.2 安全试验
每亚批疫苗皮下注射体重14～16g小白鼠，每只0.5ml，注射后第3天和第7天各观察一次，允许皮下有硬结，但应健存。
7.3 化学检定
按《生物制品化学规定规程》进行。
7.3.1pH值测定
应为5.5～6.8。
7.3.2 游离甲醛测定
应含游离甲醛，但含量应≤0.01%。
7.3.3 氢氧化铝含量测定
每ml应不超过1.25mg。
7.3.4 氯化钠含量测定
应为0.8～0.95%。
7.3.5硫柳汞含量测定
不应超过0.01%。
7.4 效力和鉴别试验
将疫苗4倍递增稀释，每个稀释度接种BALB/cH2d或NIHq型雌性小白鼠20只，每只腹腔注射1.0ml，4～6周后采血，以RIA法测定抗-HBs，计算小白鼠ED50值与参比苗ED50值，结果以检品ED50值/参比ED50值，其比值≥1为合格。
7.5 抗-HBc检测
每批用6只体重为300～350g同性豚鼠，每只腹部皮下注射疫苗0.5ml，间隔一个月免疫第2次，之后一个月心脏采血，用RIA法检测免疫前后血清，结果抗-HBc应阴性，否则应重试。
7.6人体免疫观察及标准
每年度生产的头3批疫苗或前、中、后各一批疫苗进行人体免疫观察，观察对象为小学生或学龄前儿童，按0、1、2个月程序每批至少接种20人，每人于上臂三角肌肌内注射1.0ml，于3针接种后一个月采血，用RIA法测定三项指标，抗-HBs阳性率(S/N≥10)大于90%，6个月内未出现HBsAg者判为合格，否则需要重试。对免疫后单独出现高滴度抗-HBc者应分析原因。
8 保存与效期
保存于2～8℃暗处，不得冻结。自检定合格之日起效期为2年。
1 血源
1.1 对献血员的要求
1.1.1 献血员应为20～50岁无症状HBsAg携带者，其肝功能应无显着异常，并稳定。对献血员的其他要求按《原料血浆采集(单采血浆术)规程》执行。
1.1.2个月接种过活疫苗，1年内接种过狂犬病疫苗者，均不采血。
1.1.3 必要时以免疫扩散法(ID)测定HBsAg亚型。血源应以ad亚型为主，可有少量ay亚型。
1.2 单份血浆检查
1.2.1 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
1.2.2HbsAg测定
用对流电泳法测定，HBsAg滴度应≥1∶8，或用反向血凝法(RPHA)测定，滴度应≥1∶1024。
1.3 混合血浆检查
1.3.1支原体检查
按《生物制品无菌试验规程》进行。
1.3.2 取样接种孔雀绿培养基，35～37℃培养28天，结果应为阴性。
1.3.3 外源病毒检查
用Vero细胞和人二倍体细胞各3瓶，每瓶容量为10～15ml，各接种0.2ml样品，35～37℃培养10天，应无病变出现。用0.2%～0.5%鸡与豚鼠红细胞等量混合后于37℃吸附1小时，测定血吸附反应，应均为阴性。
2 抗原的浓缩和变化
2.1 血浆脱纤维
于血浆中加入氯化钙溶液，使之脱纤维。
2.2硫酸铵沉淀
于血清中加入硫酸铵饱和溶液，或用固体硫酸铵，使最后达到适宜的饱和度，沉淀HBsA.
2.3 超离心纯化
溴化钾等密度区带离心2～3次，每次离心后分部收样，根据紫外监测峰及密度测定，合并合格的样品，经超滤去盐浓缩。蔗糖速率区带离心1～2次，分离出HBsAg。
3 灭活
3.1 胃酶处理
将HBsAg悬液加入适量胃酶，置35～37℃处理4～5小时，最后超滤去胃酶。
3.2 尿素处理
于HBsAg悬液中加尿素至4～8mol/L置37℃处理4～5小时，超滤去尿素。亦可不用尿素处理。
3.3福尔马林灭活
于HBsAg悬液中按1∶4000加入福尔马林，置37℃72～96小时。不用尿素处理者可用1∶2000福尔马林灭活。
4 稀释与吸附
已灭活的疫苗原液经除菌过滤后，根据Lowry法检测折算的特异性蛋白含量进行稀释，加入A1(OH)3吸附，并于疫苗内加入防腐剂。
5 半成品检定
5.1 总蛋白含量测定
用Lowry法测定，使用检定所提供的标准品。
5.2HBsAg含量测定
按总蛋白含量将样品稀释至不同稀释度，用RIA或火箭电泳法测定，使用检定所提供的标准品，HBsAg含量应在90%以上。
5.3 电镜检查
取每台离心机每次蔗糖离心后的样品，制作5个铜网，在60000倍电镜下，每个铜网观察6个视野，结果应主要为22nm球形颗粒，未见Dane颗粒为合格。有可疑Dane颗粒者应以加倍视野数检查。
5.4 残留杂蛋白检查
5.4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳法
浓缩胶浓度为4%，分离胶为7.5%，加10μgHBsAg样品和适量的人血清白蛋白进行电泳，银染，试验样品应不出现明显杂蛋白带。
5.4.2SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法
HBsAg样品经SDS处理后在7.0%浓缩胶和15%分离胶中加入5μg进行电泳，结果在分离胶中应主要存在22000及28000分子量带，应不出现明显的杂蛋白带。
5.5HBV DNA检查
用HBv DNA片段制备探针，取200μg除菌后的样品与探针进行杂交，结果应为阴性。控针的灵敏度应≤1pg。
5.6 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
6 分装
每支安瓿分装1.0ml，HBsAg含量分别为10μg和30μg两种规程。
7 成品检定
7.1 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
7.2 安全试验
每亚批疫苗皮下注射体重14～16g小白鼠，每只0.5ml，注射后第3天和第7天各观察一次，允许皮下有硬结，但应健存。
7.3 化学检定
按《生物制品化学规定规程》进行。
7.3.1pH值测定
应为5.5～6.8。
7.3.2 游离甲醛测定
应含游离甲醛，但含量应≤0.01%。
7.3.3 氢氧化铝含量测定
每ml应不超过1.25mg。
7.3.4 氯化钠含量测定
应为0.8～0.95%。
7.3.5硫柳汞含量测定
不应超过0.01%。
7.4 效力和鉴别试验
将疫苗4倍递增稀释，每个稀释度接种BALB/cH2d或NIHq型雌性小白鼠20只，每只腹腔注射1.0ml，4～6周后采血，以RIA法测定抗-HBs，计算小白鼠ED50值与参比苗ED50值，结果以检品ED50值/参比ED50值，其比值≥1为合格。
7.5 抗-HBc检测
每批用6只体重为300～350g同性豚鼠，每只腹部皮下注射疫苗0.5ml，间隔一个月免疫第2次，之后一个月心脏采血，用RIA法检测免疫前后血清，结果抗-HBc应阴性，否则应重试。
7.6人体免疫观察及标准
每年度生产的头3批疫苗或前、中、后各一批疫苗进行人体免疫观察，观察对象为小学生或学龄前儿童，按0、1、2个月程序每批至少接种20人，每人于上臂三角肌肌内注射1.0ml，于3针接种后一个月采血，用RIA法测定三项指标，抗-HBs阳性率(S/N≥10)大于90%，6个月内未出现HBsAg者判为合格，否则需要重试。对免疫后单独出现高滴度抗-HBc者应分析原因。
8 保存与效期
保存于2～8℃暗处，不得冻结。自检定合格之日起效期为2年。
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