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编号:50424
附录1 百日咳菌苗原液制造及检定要求
     本品系用百日咳第Ⅰ相菌种经培育后取菌体制成悬液,加适当杀菌剂,以磷酸盐缓冲生理盐水稀释制成,每ml含菌45亿~90亿。用于制备百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂。

    1 菌种

    1.1 制造百日咳菌苗之菌种、检定用的Ⅰ相诊断血清、百日咳分型血清及百日咳参考菌苗,由中国药品生物制品检定所分发或经同意。

    1.2 菌种检定

    1.2.1 培养特性

    于包-姜(Bordet-Gengou)氏或其他适宜的培养基上培育,各菌株应具有典型的形态及生化特性。

    1.2.2 血清学特性

    将35~37℃培育40~48小时的菌苔,混悬于生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水内,使每ml含菌20亿个,与Ⅰ相血清做定量凝集反应,凝集效价应达到血清原效价之半。同时与单价分型血清做定量凝集反应,其型别应与该菌种标定型别相同。

    1.2.3皮肤坏死试验

    用健康家兔或豚鼠至少2只,用培育40~48小时的菌苔混悬于磷酸盐缓冲生理盐水内,然后稀释为几个不同浓度的菌液,分别用每一稀释度的菌液注射于家兔或豚鼠的皮内0.1ml,经72小时观察反应。如2只家兔或豚鼠中有1只注射0.4亿个菌以下的菌液部位出现出血性坏死者为阳性反应,判为合格。

    1.2.4 毒力试验

    用体重16~18g之小白鼠至少3组,每组至少10只,在麻醉状态下从鼻腔滴入经培育40~48小时,以磷酸盐缓冲生理盐水稀释的菌液0.05ml观察14天,记录小白鼠生死情况,按Reed Muench法计算LD50,LD50菌数不超过1.2亿判为合格。

    1.2.5 免疫力试验

    1.2.5.1 方法

    按附录2《百日咳菌苗原液免疫力试验方法》进行。

    1.2.5.2判定

    试验菌液每个接种剂量的免疫效价应不少于4.0IU。若试验菌液的效价低于此要求时,可复试,其结果的几何平均值(如用概率分析法时,应用加权几何平均值)≥4.0IU,仍判为合格。

    1.3 菌种保存

    1.3.1 菌种应用冻干法保存。

    1.3.2 冻干菌种应保存在2~8℃。冻干后抽样按1.2项进行检查,合格的菌种可使用2年,以后每年检查1次,如仍合格可继续使用1年。

    2. 制造

    2.1 制造百日咳菌苗原液至少应选用2个菌株,制成的菌苗应含1、2、3型因子。

    2.2 制造百日咳菌苗原液用活性炭半综合培养基或其他适宜的培养基。如用液体培养基,不得含有已知引起人体毒性或变态反应的成分。

    2.3 原液制造

    2.3.1 菌种

    冻干菌种启开后接种于改良包-姜氏或活性炭半综合培养基或其他适宜的培养基上。于35~37℃培育不超过72小时,以后各代不超过48小时,传代菌种保存不得超过14天,冻干菌种启开后用于生产时不应超过10代。

    2.3.2 培育

    可用固体法或液体法培育。培育时间不得超过48小时,经检查为纯菌后,用适当方法收集菌体,混悬于pH值为7.0~7.4的磷酸盐缓冲生理盐水中。

    2.3.3 杀菌

    原液可用不超过0.1%(ml /ml)甲醛溶液杀菌,放37℃2~3天。亦可用其他适宜的杀菌剂和杀菌方法杀菌。

    2.3.4纯菌试验

    原液应逐瓶(罐)抽样接种普通琼脂斜面及普通血液琼脂斜面(或活性炭半综合培养基)各1管,放35~37℃培育2天,然后放24~26℃1天。有杂菌生长者应废弃。

    2.3.5 原液合并

    固体法工艺生产经纯菌试验合格的原液应进行合并。不同菌株不同日期制造2的原液应分别合并。合并后,可加适量防腐剂,并保存于2~8℃。

    2.4 原液检定

    2.4.1 浓度测定

    每瓶原液应按中国细菌浊度标准与质量检定部门会同测定浓度。稀释菌苗时即按此浓度计算。

    2.4.2 镜检

    每瓶原液取样稀释至成品浓度,涂片染色镜检,应为革兰氏阴性球杆菌。至少观察10个视野,应无杂菌。

    2.4.3 凝集反应

    每瓶原液按1.2.2项与Ⅰ相血清做定量凝集试验,其凝集效价应达血清原效价之半,如仅达到或低于血清原效价1/4时,应作免疫力试验,合格后方可使用;同时应用单价分型血清做定性凝集试验,其所含型别应与制造原液的菌种型别相同。

    2.4.4 无菌试验

    每瓶原液除按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验外,并做特异无菌试验。如特异无菌试验有百日咳菌生长,可复试一次,若仍有百日咳菌生长,原液应判为不合格。

    2.4.5 毒性试验

    2.4.5.1方法

    按附录3《百日咳菌苗原液毒性试验方法》进行。

    2.4.5.2 判定

    试验组小白鼠注射后72小时的总体重不少于注射前总体重,第7天小白鼠增加的体重不少于对照组增加体重的60%,并不得有死亡,该批原液毒性试验判为合格。

    试验结果达不到上述要求,可复试一次。仍达到不过要求,可将原液放置1.2.5项方法及要求进行。

    2.5 原液保存

    应保存于2~8℃。原液自采集之日起至成品发出不得少于4个月。原液自采集之日起效期为3年。