附录三 全血细胞培养染色体技术常用试剂配制
一、国内实验室应用试剂配制
(一)培养液
(1)RPMI1640培养液：称取RPMI培养基9.8g，碳酸氢钠1.9g、青霉素100u/ml，加双蒸水至1000ml，调节 pH7.2～7.4无菌过滤冻存备用。
(2)小牛血清商品：成都生物制品厂。
(3)植物凝集素(PHA)：自制或成品(重庆药检所)。
(4)pH调整液：5%NaHCO3溶液高压灭菌(8磅15min)，0.1N稀盐酸液100ml。
(5)秋水仙素：10mg/ml无菌过滤高压灭菌(8磅10min)。
(6)磷酸缓冲液：pH7.4。
磷酸氢二钠28.8g(H2O)、磷酸二氢钾2.67g(无水)，溶于1000ml双蒸水中，加肝素，终浓度为100u/ml。
(7)Giemsa染色液：
Giemsa粉剂 1g
甘油66ml
在研钵中，加入少量甘油油仔细研磨然后放甘油全部加磨，60℃温箱中保温2h，冷却后加入甲醇66ml。装入有色瓶中混合待用。染色时用pH7.4磷酸缓冲液稀释10倍，随配随用。
(二)固定液
(1)甲酸：冰乙酸3：1混合即用。
(2)PBS缓冲液配制：
NaCl 16gNa2HPO4(12H2O)5.65g
KCl 0.4g KH2PO40.4g
加双蒸水至1000ml pH7.0。
取5%胰酶(生理盐水配制)1ml加入50ml PBS液中(最终浓度为0.025%)，4℃冰箱待用。
二、细胞培养(Bhatl B和McGee JOD,1990)
1.完全培养基
RPMI76.0ml
胎牛血清 20.0ml
植物凝集素2.0ml
抗生素/抗菌素溶液(100×)1.0ml
L-谷氨酰胺(100×) 1.0ml
2.BudR(5’-Bromo-2-deoxyuridine,5’-溴-2-脱氧尿嘧啶)溶解10mg/ml BudR于dH2O中，0.2μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃储存，BudR要在柔光(弱光)下操作。
3.胸腺嘧啶(Thymidine,Thd)按250μg/ml溶解于dH2O中，过滤后分装储存于-20℃。
4.Colcemid(Sigma)5.0μg/ml溶于dH2O中，过滤后分装储存于-20℃。
5.KCl(0.75mol/L)溶解560mg于100ml dH2O中，新鲜配制37℃保存。
6.固定剂甲醇冰醋酸按3：1(V/V)混合即可，现用现配，置冰上待用。
7.缺口平移试剂盒(Amersham和BRL公司)
8.生物素7-dATP(BRL)
9.糖原(BRL)
10.RNA酶A(Sigma)
(1)储备液
称取RNA酶A 1g溶于100ml醋酸钠中，置沸水中煮10min，分装后储于-20℃。
(2)工作液
用储备液按1：100稀释。
11.20×SSC
NaCl 175g
柠檬酸三钠 88g
dH2O1000ml
固定试剂溶解后，dH2O定容至1000ml，调pH至7.4，高压灭菌。
12.杂交液(高深度，HMmix)
去离子甲酰胺 6.0ml
100×Denhardt’s液1.0ml
50%硫酸葡聚糖 2.0ml
1%人或鲑精DNA※
20×SSC
※：临用前加入，终浓度为100～200μg/ml。
该液为高浓度杂交液， 存于4℃。
13.PBT液
BSA 5%
TristonX-100/(PBS) 0.1%
注：BSA液用前应用Whatman 3mm滤纸过滤。
14.兔抗生物素(α-生物素)单克隆抗体
用PBT液1：100稀释。
该单抗现可从英国Dako公司购得。
15.金(10～20nm)标羊抗兔二抗
用PBT液1：50稀释。
16.银溶液(Janesen)
17.Hoedst33258(Sigma)
储备液(100×)
Hoedst染料 5mg
甲醇 10ml
工作液：用2×SSC 1：100稀释储备液。
(一)培养液
(1)RPMI1640培养液：称取RPMI培养基9.8g，碳酸氢钠1.9g、青霉素100u/ml，加双蒸水至1000ml，调节 pH7.2～7.4无菌过滤冻存备用。
(2)小牛血清商品：成都生物制品厂。
(3)植物凝集素(PHA)：自制或成品(重庆药检所)。
(4)pH调整液：5%NaHCO3溶液高压灭菌(8磅15min)，0.1N稀盐酸液100ml。
(5)秋水仙素：10mg/ml无菌过滤高压灭菌(8磅10min)。
(6)磷酸缓冲液：pH7.4。
磷酸氢二钠28.8g(H2O)、磷酸二氢钾2.67g(无水)，溶于1000ml双蒸水中，加肝素，终浓度为100u/ml。
(7)Giemsa染色液：
Giemsa粉剂 1g
甘油66ml
在研钵中，加入少量甘油油仔细研磨然后放甘油全部加磨，60℃温箱中保温2h，冷却后加入甲醇66ml。装入有色瓶中混合待用。染色时用pH7.4磷酸缓冲液稀释10倍，随配随用。
(二)固定液
(1)甲酸：冰乙酸3：1混合即用。
(2)PBS缓冲液配制：
NaCl 16gNa2HPO4(12H2O)5.65g
KCl 0.4g KH2PO40.4g
加双蒸水至1000ml pH7.0。
取5%胰酶(生理盐水配制)1ml加入50ml PBS液中(最终浓度为0.025%)，4℃冰箱待用。
二、细胞培养(Bhatl B和McGee JOD,1990)
1.完全培养基
RPMI76.0ml
胎牛血清 20.0ml
植物凝集素2.0ml
抗生素/抗菌素溶液(100×)1.0ml
L-谷氨酰胺(100×) 1.0ml
2.BudR(5’-Bromo-2-deoxyuridine,5’-溴-2-脱氧尿嘧啶)溶解10mg/ml BudR于dH2O中，0.2μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃储存，BudR要在柔光(弱光)下操作。
3.胸腺嘧啶(Thymidine,Thd)按250μg/ml溶解于dH2O中，过滤后分装储存于-20℃。
4.Colcemid(Sigma)5.0μg/ml溶于dH2O中，过滤后分装储存于-20℃。
5.KCl(0.75mol/L)溶解560mg于100ml dH2O中，新鲜配制37℃保存。
6.固定剂甲醇冰醋酸按3：1(V/V)混合即可，现用现配，置冰上待用。
7.缺口平移试剂盒(Amersham和BRL公司)
8.生物素7-dATP(BRL)
9.糖原(BRL)
10.RNA酶A(Sigma)
(1)储备液
称取RNA酶A 1g溶于100ml醋酸钠中，置沸水中煮10min，分装后储于-20℃。
(2)工作液
用储备液按1：100稀释。
11.20×SSC
NaCl 175g
柠檬酸三钠 88g
dH2O1000ml
固定试剂溶解后，dH2O定容至1000ml，调pH至7.4，高压灭菌。
12.杂交液(高深度，HMmix)
去离子甲酰胺 6.0ml
100×Denhardt’s液1.0ml
50%硫酸葡聚糖 2.0ml
1%人或鲑精DNA※
20×SSC
※：临用前加入，终浓度为100～200μg/ml。
该液为高浓度杂交液， 存于4℃。
13.PBT液
BSA 5%
TristonX-100/(PBS) 0.1%
注：BSA液用前应用Whatman 3mm滤纸过滤。
14.兔抗生物素(α-生物素)单克隆抗体
用PBT液1：100稀释。
该单抗现可从英国Dako公司购得。
15.金(10～20nm)标羊抗兔二抗
用PBT液1：50稀释。
16.银溶液(Janesen)
17.Hoedst33258(Sigma)
储备液(100×)
Hoedst染料 5mg
甲醇 10ml
工作液：用2×SSC 1：100稀释储备液。