第八节 免疫胶体铁细胞化学
胶体铁(Ferric Colloid)是一种阳离子胶体，可通过普鲁士蓝反应呈色，其颗粒有一定的大小及电子密度，最初被用于光镜及电镜下定位组织中的阴离子部位(Hale,1946Seno,etal, 1983,Murakami， et al 1986)。1989年日本学者Seno等在抗体分子上标记了胶体铁，将胶体铁引入免疫细胞化学技术(Seno,et al. 1989)。杨守京等在胶体的制备方法及其标记物的纯化等方面做了改进，成功地用于流行性出血热病毒抗原的检测(杨守京，等，1992)。该方法具有较高的特异性与敏感性，背景染色干净。
一、胶体铁的制备方法
早期制备的胶体铁作为阳离子胶体是用于检查组织中阴离子的定位，其制备主要是通过三氯化铁(FeCl3)的煮沸完成的，如有：(1)FeCI3直接煮沸(Hale ,1946):(2)FeCl3溶于甘氨酸和氨水的混和液中(Rinehart,1951):(3)FeCl3倒入煮沸的二甲坤酸钠溶液中(Seno.et al,1983)。或FeCl3与二甲砷酸溶液一起煮沸(Seno ,et al.1985)其后，制备方法不断改进，1986年Murakam 等用水合联胺二甲砷酸-FeCl3煮沸法制备出微细颗粒胶体铁(Fine-granular cationic iron colloid),胶体颗粒小(0.5～1nm),从而使其稳定性及穿透能力大大增加(Murakarmi,et al.1986)。用二甲砷酸代替二甲砷酸钠也可以获得同样胶体，具体步骤如下：在60ml 0.1mol/LFeCl33ml，将混合物加热煮沸至变成深棕红色为胶体砷酸铁。室温冷却后，再以二倍于原体积的0.1mol/LpH7.4的二甲砷酸钠缓冲液(Cacdylate sodium Buffer pH7.4,CB)稀释，即可进行抗体标记。该方法制备的铁胶体呈深红色，颗粒大小1nm左右，在pH4～8范围内稳定，4℃可存放一个月以上，室温存放半个月，阴离子定位分布同Murakami等的胶体铁，与IR-COO-有较强的亲和力，但不与IR-NH+结合。
二、抗体的标记和纯化
胶体铁的等电点为7.8至7.9,在pH7.4时通过离子键能与抗体IgG(pH5.8～7.3)结合而不影响抗体活性,在此条件下,Seno＇对Hale＇胶体铁进行了抗体标记,并成功用于免疫细胞化学染色(Seno,et al.1989),抗体标记时,用0.1mol/L碳酸钾将胶体的pH调至7.4按每毫升脱体铁0.2～1mg的蛋白量,将IgG在电磁搅拌下逐滴加入到胶体铁,搅拌5min后,通过CB平衡的Amber liaht CC-50层析柱,CB洗脱纯化.作者在胶体铁的制备方法进行了改进,吸收了Murakami等胶体的优点,所制备的胶体铁,颗粒小,稳定性高,其pH值近中性,标记效果好,CM-sephadex C-50(Pharmacia)可取代Amberlight CG-50用于纯化标记抗体(杨守京,等,1992)。
三、胶体铁标记抗体的鉴定
用免疫斑点法或免疫细胞化学染色等方法可鉴定抗体的标记效果
1.免疫斑点法 在处理好的硝酸纤维素膜上分别滴加100～10-7系列稀释的抗原，斑点直径0.25cm, 空气中干燥，80℃多聚甲醛蒸气固定1h，然后分别以胶体铁标记的抗体一步法或用桥抗联接胶体铁标记物的间接法染色，普鲁士蓝呈色观察。一步法所难检测到的抗原量为10-2～10-3μg,间接法 敏感性至少增加10倍(10-3～10-4μg)。
2.免疫细胞化学染色法 步骤同下，方法敏感性同免疫金银法(IGSS)，优点是背景干净。
四、免疫胶体铁细胞化学染色
(1)组织切片脱蜡入水，0.01mol/l pH7.4 PBS洗；
(2)用4%正常羊血清封闭组织37℃ ，30min。
(3)分别以第一抗体孵育组织，4℃24h，PBS振洗10min×3；
(4)用胶体铁标记的第二抗体37℃孵育30min或用桥抗联接胶体铁标记物；
(5)蒸馏水洗；
(6)以1%的亚铁氰化钾与1%盐酸混合液显色20in；
(7)自来水洗 ；
(8)核固红染核，脱水，透明、封片。
以该方法染色，阳性为蓝色，胞核为红色。
五、方法的应用
胶体铁的呈色产物亚铁氰化铁是一络合物(解离常数1×10-35)，一经形成，难以再与其它化学物质发生反应。蓝色的亚铁氰化铁与棕色的DAB产物及黑色的银颗粒颜色对比明显，因此强结合免疫酶及IGSS进行光镜下抗原的双标及多标记。胶体铁(颗粒1nm)标记抗体直径比常用胶体金(5～40nm)及铁蛋白标记抗体(12nm)小，因而对固定组织具有更好的穿透力，可用于抗原的超威结构定位，尤其是免疫电镜的包埋前染色。结合免疫酶及不同大小胶体金标记抗体，还可用于抗的双标记及多标记。
非特异性背景染色是免疫组化染色过程中经常遇到的问题。组织中的内源性过氧化酶活性及色素常会干扰免疫过氧化酶染色；而胶体金非特异性吸附组织是构成IGSS背景染色的主要原因。胶体铁与抗体结合呈电中性后，很少再与组织发生吸附，并且其染色不受内源酶活性的干扰。普鲁士蓝反应只显示标记的三价铁，不能显示组织中内源性二价铁(除外含铁血黄素，但可通过连续切片H·E染色对照排除)，因而背景干净。另外免疫斑点试验和组织染色结果表明，免疫胶体铁间接法敏感性与IGSS基本相同但高于ABC染色，从上述两方面看，该方法要优于免疫酶及免疫金银染色。
一、胶体铁的制备方法
早期制备的胶体铁作为阳离子胶体是用于检查组织中阴离子的定位，其制备主要是通过三氯化铁(FeCl3)的煮沸完成的，如有：(1)FeCI3直接煮沸(Hale ,1946):(2)FeCl3溶于甘氨酸和氨水的混和液中(Rinehart,1951):(3)FeCl3倒入煮沸的二甲坤酸钠溶液中(Seno.et al,1983)。或FeCl3与二甲砷酸溶液一起煮沸(Seno ,et al.1985)其后，制备方法不断改进，1986年Murakam 等用水合联胺二甲砷酸-FeCl3煮沸法制备出微细颗粒胶体铁(Fine-granular cationic iron colloid),胶体颗粒小(0.5～1nm),从而使其稳定性及穿透能力大大增加(Murakarmi,et al.1986)。用二甲砷酸代替二甲砷酸钠也可以获得同样胶体，具体步骤如下：在60ml 0.1mol/LFeCl33ml，将混合物加热煮沸至变成深棕红色为胶体砷酸铁。室温冷却后，再以二倍于原体积的0.1mol/LpH7.4的二甲砷酸钠缓冲液(Cacdylate sodium Buffer pH7.4,CB)稀释，即可进行抗体标记。该方法制备的铁胶体呈深红色，颗粒大小1nm左右，在pH4～8范围内稳定，4℃可存放一个月以上，室温存放半个月，阴离子定位分布同Murakami等的胶体铁，与IR-COO-有较强的亲和力，但不与IR-NH+结合。
二、抗体的标记和纯化
胶体铁的等电点为7.8至7.9,在pH7.4时通过离子键能与抗体IgG(pH5.8～7.3)结合而不影响抗体活性,在此条件下,Seno＇对Hale＇胶体铁进行了抗体标记,并成功用于免疫细胞化学染色(Seno,et al.1989),抗体标记时,用0.1mol/L碳酸钾将胶体的pH调至7.4按每毫升脱体铁0.2～1mg的蛋白量,将IgG在电磁搅拌下逐滴加入到胶体铁,搅拌5min后,通过CB平衡的Amber liaht CC-50层析柱,CB洗脱纯化.作者在胶体铁的制备方法进行了改进,吸收了Murakami等胶体的优点,所制备的胶体铁,颗粒小,稳定性高,其pH值近中性,标记效果好,CM-sephadex C-50(Pharmacia)可取代Amberlight CG-50用于纯化标记抗体(杨守京,等,1992)。
三、胶体铁标记抗体的鉴定
用免疫斑点法或免疫细胞化学染色等方法可鉴定抗体的标记效果
1.免疫斑点法 在处理好的硝酸纤维素膜上分别滴加100～10-7系列稀释的抗原，斑点直径0.25cm, 空气中干燥，80℃多聚甲醛蒸气固定1h，然后分别以胶体铁标记的抗体一步法或用桥抗联接胶体铁标记物的间接法染色，普鲁士蓝呈色观察。一步法所难检测到的抗原量为10-2～10-3μg,间接法 敏感性至少增加10倍(10-3～10-4μg)。
2.免疫细胞化学染色法 步骤同下，方法敏感性同免疫金银法(IGSS)，优点是背景干净。
四、免疫胶体铁细胞化学染色
(1)组织切片脱蜡入水，0.01mol/l pH7.4 PBS洗；
(2)用4%正常羊血清封闭组织37℃ ，30min。
(3)分别以第一抗体孵育组织，4℃24h，PBS振洗10min×3；
(4)用胶体铁标记的第二抗体37℃孵育30min或用桥抗联接胶体铁标记物；
(5)蒸馏水洗；
(6)以1%的亚铁氰化钾与1%盐酸混合液显色20in；
(7)自来水洗 ；
(8)核固红染核，脱水，透明、封片。
以该方法染色，阳性为蓝色，胞核为红色。
五、方法的应用
胶体铁的呈色产物亚铁氰化铁是一络合物(解离常数1×10-35)，一经形成，难以再与其它化学物质发生反应。蓝色的亚铁氰化铁与棕色的DAB产物及黑色的银颗粒颜色对比明显，因此强结合免疫酶及IGSS进行光镜下抗原的双标及多标记。胶体铁(颗粒1nm)标记抗体直径比常用胶体金(5～40nm)及铁蛋白标记抗体(12nm)小，因而对固定组织具有更好的穿透力，可用于抗原的超威结构定位，尤其是免疫电镜的包埋前染色。结合免疫酶及不同大小胶体金标记抗体，还可用于抗的双标记及多标记。
非特异性背景染色是免疫组化染色过程中经常遇到的问题。组织中的内源性过氧化酶活性及色素常会干扰免疫过氧化酶染色；而胶体金非特异性吸附组织是构成IGSS背景染色的主要原因。胶体铁与抗体结合呈电中性后，很少再与组织发生吸附，并且其染色不受内源酶活性的干扰。普鲁士蓝反应只显示标记的三价铁，不能显示组织中内源性二价铁(除外含铁血黄素，但可通过连续切片H·E染色对照排除)，因而背景干净。另外免疫斑点试验和组织染色结果表明，免疫胶体铁间接法敏感性与IGSS基本相同但高于ABC染色，从上述两方面看，该方法要优于免疫酶及免疫金银染色。