第三节 无特定病原体动物
一、无特定病原体动物的概念
无特定病原体(Specefic pathogen Free,SPF)动物是指机体内无特定的微生物和寄生虫存在的动物，但非特定的微生物和寄生虫是容许存在的。故实际上是指无传染病的健康动物。这类动物是目前国外使用最广泛的实验动物，它的来源，既可来自无菌动物繁育的后裔，亦可经剖胎取后，在隔离屏障设施的环境中，由SPF亲代动物抚育。它不带有对人或动物本身致病的微生物，但不能排除可经胎盘屏障垂直传播的微生物。
由于用疫苗和药物进行预防及治疗，或用淘汰带菌动物来作出SPF动物的方法并不实用(既浪费时间，又难保确除病原)，故一般大多先培育无菌动物或悉生动物后，再把其移到有封闭系统设施中去饲育繁殖。原则上SPF动物室内不容许存在病原菌，但在封闭的环境中，难免有很多非病原性微生物会逐渐进入动物机体中去，故亦有人把这个转移过程称之为通常动物化。SPF动物的祖先是无菌动物，按理来说，无菌动物的子宫内和卵中是无菌的，然而，有些微生物实际上是通过其亲代传给胎儿的，因此，培育无菌动物和SPF动物之前，就必须考虑这个问题。即应该严格地选择剖腹产母体，该动物应未感染上规定的各种微生物和寄生虫，最好通过几代连续剖腹，来培育原种无菌动物后再培育SPF动物。
“SPF”一词的含义是不明确的，因为在特定条件下，“非”病原体是可以成为病原体的。而且有些病原体目前缺乏有效的检查手段。“SPF”是多年来使用的名称。目前还没有更好的统一的名称，所以仍沿用。现在有COBS(经剖腹产取得并饲养在屏障中的)、BS(在屏障系统中饲养)、DF(无病)等不同名称，都是指“SPF”动物。
二、无特定病原体动物的质量标准
由于SPF动物的质量标准看法不一，所以对动物的要求也就不同。如有人认为某种实验动物没有某种病原体，不影响其实验要求，就可称为SPF动物。亦有人认为将常见的病原体全部排除，才算是真正的动物。我们认为这两种看法都不够恰当，前者要求过低、太简单化，后者又要求过高，复杂化。没有统一标准，就无所适从。国外对动物的监测标准(内容和方法)尚未见公诸于世，没有统一的标准。如以小鼠为典型例子，因为小鼠是实验研究中使用最广，用量最多的实验动物，它是自发性疾病种类最多的动物之一，综合英、美、日等国有关资料，列于表，以资借鉴。
英、美、日等国有关实验小鼠微生物学监测内容
资 料 来 源
美
日美
日
英
英美日
日
美
病原微生物种类
细
菌
性
疾
病
沙门氏杆菌
√
√
√
√
√
√
√
绿脓杆菌
√
√
√
√
魏氏梭菌D型
√
√
枸椽酸杆菌
√
√
大肠杆菌
√
√
√
√
假性结核杆菌
√
李司忒杆菌
√
√
巴氏杆菌
√
√
√
√
√
√
支气管败血性鲍特氏菌
√
√
√
√
√
肺炎雷伯克氏菌
√
肺炎双球菌
√
√
√
鼠棒状杆菌
√
√
√
√
√
√
√
泰泽氏杆菌
√
√
√
√
√
√
结核杆菌
√
√
钩端螺旋体
√
√
念珠状链球菌
√
√
√
溶血性链球菌
√
√
√
金黄色葡萄球菌
√
病
毒
性
疾
病
淋巴细胞性脉络丛脑膜炎
√
√
√
√
√
鼠肝炎
√
√
√
√
√
鼠肺炎
√
√
√
呼肠弧Ⅲ
√
√
√
√
仙台病毒
√
√
√
√
仔鼠流行性腹泻
√
√
小鼠脊髓灰质炎
√
√
√
脱脚病
√
√
√
√
√
K病毒
√
√
√
鼠细小病毒
√
√
√
√
胸腺病毒
√
√
多瘤病毒
√
√
√
啮齿动物腺病毒
√
√
√
啮齿动物巨动物病毒
√
如前所述，目前国际上对小鼠微生物监测内容尚无统一标准，各国亦常有变动现象，随着科学研究的发展，必然发现新问题，增添新内容，仅就不完全的资料，按表6-6统计，微生物监测内容，计细菌种，病毒种。结合我国实际，卫生部上海生物制品研究所制定的小鼠微生物和寄生虫质量监测标准可见表，他们主要着眼于“根据对小鼠群有危害的病原体及对动物实验研究有干扰的微生物、寄生虫”为原则，结合他们的具体条件，参照国外有关资料，似订的暂定标准，由浅入深，逐步提高，以达到目前国际上若干国家所订内容。
表实验小鼠微生物和寄生虫质量监测暂定标准(1983)
动物等级
一
悉生、无菌
二
SPF
三
清洁
四
普通
项 目
沙门氏菌
悉生小鼠
√
√
√
结核分枝杆菌
√
√
√
假结核耶尔森氏菌
√
√
√
皮肤真菌
√
√
√
鼠肝炎病毒
√
√
仙台病毒
√
√
脱脚病病毒
√
√
肺炎支原体
√
√
柯希氏棒状杆菌
√
√
亲肺巴斯德氏菌
√
√
支气管败血性鲍特氏菌
√
√
胸炎克雷伯氏菌
√
√
念株状链球菌
√
√
Tyzzer′s病原体
√
√
肺炎链球菌
√
√
单核细胞增多性李斯德氏菌
√
√
金黄色葡萄球菌
√
√
体外寄生虫
√
√
涤虫
√
√
绿脓假单胞菌
√
枸椽酸杆菌
√
大肠埃希氏菌O115aCK(B)
√
线虫
√
“√”表示应排除项目
上海市卫生系统实验动物微生物等级初步试行标准(讨论稿)可参看表6-8
上海卫生系统实验动物微生物等级初步试行标准(1985)
动物级别
应排除病原
小鼠
大鼠
地鼠
家兔
豚鼠
无特定病原体动物
清洁动物
普通动物
肠炎杆菌
√
√
√
√
√
鼠伤寒杆菌
√
√
√
√
√
体外寄生虫
√
√
√
√
√
发癣菌
√
√
淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒
流行性出血热病毒
√
√
√
脱脚病病毒
√
出血败血性巴氏杆菌
√
√
鼠棒状杆菌
√
支气管败血波氏杆菌
√
√
√
肠道寄生虫
√
泰泽氏病
√
仙台病毒
√
鼠肝炎病毒
√
呼肠弧Ⅲ病毒
嗜肺巴氏杆菌
√
绿脓杆菌
√
链球菌(A群)
√
各型肺炎球
√
肺支原体
金黄色葡萄球菌(裸鼠)
√
三、无特定病原体动物的用途
SPF动物由于排除了传染病和寄生虫，因此实验结果准确可靠，在生物医学各个领域的研究中得到了广泛的应用和肯定，SPF动物和普通动物在实验中的使用优点和医学科学各研究领域应用不同类型动物的选择可参见表6-3和表6-4。
通常的动物群中有许多病原体是隐性感染，在一般条件下，微生物与宿主间能保持相对平衡，动物不显现症状。一旦条件变化或动物在承受实验处理的影响下，这种平衡遭到破坏，隐性感染被激发，动物出现疾病的症状，这将严重地干扰实验的结果。尤其在非短期的实验中，这种现象(包括动物的死亡)在时间上、经济上以及实验的准确性方面，将带来巨大的损失。SPF动物就不会有这种现象，因此，近十几年来，SPF动物已成为标准的实验动物，其使用量不断增加，并有逐步取代普通动物的趋势。
绿脓杆菌的自然界中广泛存在，通常对动物不致病，对大鼠和小鼠的繁殖也没有影响，但用污染本菌的动物进行放射性照射试验时，却能诱发动物致死性的败血症。污染大肠杆菌、变形菌、葡萄球菌或某些极普通细菌的动物，经照射、实验性烧伤或可的松处理，也能出现这种现象。消化道寄生虫，除大量寄生虫外，对宿主常无严重影响，但在放射性照射试验中，消化道寄生虫所致的损伤部位，发生弥漫性出血感染，致使动物死亡。因此SPF动物在放射、烧伤等研究中比普通动物有稳定的应用价值。
SPF动物体内尚带有一些非病原性微生物，带菌情况不如悉生动物那样清楚明瞭，但它可以较安全、可靠地排除用普通动物作实验研究时所带病原体的干扰。
四、无特定病原体动物的培育
1.必须饲养在屏障系统内：培育SPF动物的目的的是为实验提供没有传染病的健康动物，因此SPF动物应饲养于屏障系统(密封的饲养室或超净饲养架)内，实行严格的微生物。应定期、按规定的监测内容和方法来检查有无致病菌(即特定的病原体)的污染。污染的动物依不同情况应降低等级或全部淘汰。一旦发生污染应彻底调查污染的原因。在被污染的屏障系统中工作的人员，往往附有与动物污染的同样微生物，应引起注意。
由于SPF环境中没有致病微生物，所以SPF动物的生产效果比普通动物为好，饲养中一般损失小。但屏障内一旦遭到污染，病原体的传播却更强烈。所以保持屏障系统的完好是非常重要的。
2.必须严格选择原种：SPF动物群的建立，其原种必须来源于无菌动物或悉生动物才能保证。即将悉生动物或无菌动物饲养于屏障系统的饲养室中，使之自然感染特定病原体以外的一般微生物，但应严格防范病原体的污染，并需要定期检查。
当然培育SPF动物，是以卵或子宫内无病原体为前提的。某些病原体可以垂直感染给胎儿，这个问题在培养SPF动物时应充分考虑。即应当严格选择剖腹产母体，该动物应未感染上述病原体，最好通过几代连续剖腹，来培育原种无菌动物，作为培育SPF动物的原种。
3.必须严格掌握SPF的质量标准：SPF动物必须首先排除各种人畜共患的传染病病原体，还应排除影响该种动物生产和实验使用上产生干扰的病原体。SPF动物质量监测标准应参照表6-7执行。当然我们不必完全照抄外国监测标准的内容，在培育SPF动物中，可根据我国具体情况，注意轻重缓急，先排除危害较大的病原体。上海生物制品研究所在这方面有下面几点经验体会。
⑴小鼠的淋巴细胞性脉络膜丛脑膜炎感染问题。虽然本病毒可通过胎盘传递，对人也有一定影响，是应该列入监测内容的，但其感染率极低，似可暂缓进行，宜先着重于呼肠弧类病毒或腺病毒的监测。
⑵有些病毒性病种，如有瘤病毒、胸腺病毒等，国内也未见有关报导，甚至可能国内尚难获得标准毒株，似宜在今后调查研究的基础上，考虑是否有必要列入我们监测标准的内容中。
⑶细菌性疾病中如结核病、李司忒菌病等仅是地区性的或特殊品系的偶发病种，亦不是当前我们需要监测的内容。
⑷我国近来自国外引进鼠种日益增多，可能会发生一些外来疫源。众所周知，自然疫源与地理区域有很大关系。国外引进的鼠种，来自日本的也不少，日本与我国相邻，地理条件较接近，如在欧洲国家中没有列入监测内容的大肠杆菌O115及枸椽酸杆菌，日本学者却很重视这些细菌，并列为监测内容，它又是小鼠易患的肠道传染病之一。在这方面我们应引起足够重视，即要探索自己的鼠群是否存这些病原，同时又要对外来鼠种加以监测。
⑸带有绿脓杆菌的小鼠，一般来说不影响它的生长发育和繁殖性能，亦不出现症状，但使用于抑制免疫机能实验时，可出现菌血症而发病，甚至死亡。该菌广泛存在于自然界，且具固有的抗药性，是较难在鼠群中排除的一种细菌。鼠群中是否存在绿脓杆菌，亦可间接反映管理SPF小鼠水平的一个侧面，所以亦宜列入监测质量内容中。
⑹霉形体种属繁多，在啮齿类动物中，小鼠的自然感染率远较豚鼠、家兔危害性小，但可引起多种症状，特别是侵犯鼠关节炎的霉形体，如伴随继发感染，易与鼠痘症状混淆，因此，亦应注意监测。
无特定病原体(Specefic pathogen Free,SPF)动物是指机体内无特定的微生物和寄生虫存在的动物，但非特定的微生物和寄生虫是容许存在的。故实际上是指无传染病的健康动物。这类动物是目前国外使用最广泛的实验动物，它的来源，既可来自无菌动物繁育的后裔，亦可经剖胎取后，在隔离屏障设施的环境中，由SPF亲代动物抚育。它不带有对人或动物本身致病的微生物，但不能排除可经胎盘屏障垂直传播的微生物。
由于用疫苗和药物进行预防及治疗，或用淘汰带菌动物来作出SPF动物的方法并不实用(既浪费时间，又难保确除病原)，故一般大多先培育无菌动物或悉生动物后，再把其移到有封闭系统设施中去饲育繁殖。原则上SPF动物室内不容许存在病原菌，但在封闭的环境中，难免有很多非病原性微生物会逐渐进入动物机体中去，故亦有人把这个转移过程称之为通常动物化。SPF动物的祖先是无菌动物，按理来说，无菌动物的子宫内和卵中是无菌的，然而，有些微生物实际上是通过其亲代传给胎儿的，因此，培育无菌动物和SPF动物之前，就必须考虑这个问题。即应该严格地选择剖腹产母体，该动物应未感染上规定的各种微生物和寄生虫，最好通过几代连续剖腹，来培育原种无菌动物后再培育SPF动物。
“SPF”一词的含义是不明确的，因为在特定条件下，“非”病原体是可以成为病原体的。而且有些病原体目前缺乏有效的检查手段。“SPF”是多年来使用的名称。目前还没有更好的统一的名称，所以仍沿用。现在有COBS(经剖腹产取得并饲养在屏障中的)、BS(在屏障系统中饲养)、DF(无病)等不同名称，都是指“SPF”动物。
二、无特定病原体动物的质量标准
由于SPF动物的质量标准看法不一，所以对动物的要求也就不同。如有人认为某种实验动物没有某种病原体，不影响其实验要求，就可称为SPF动物。亦有人认为将常见的病原体全部排除，才算是真正的动物。我们认为这两种看法都不够恰当，前者要求过低、太简单化，后者又要求过高，复杂化。没有统一标准，就无所适从。国外对动物的监测标准(内容和方法)尚未见公诸于世，没有统一的标准。如以小鼠为典型例子，因为小鼠是实验研究中使用最广，用量最多的实验动物，它是自发性疾病种类最多的动物之一，综合英、美、日等国有关资料，列于表，以资借鉴。
英、美、日等国有关实验小鼠微生物学监测内容
资 料 来 源
美
日美
日
英
英美日
日
美
病原微生物种类
细
菌
性
疾
病
沙门氏杆菌
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√
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√
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绿脓杆菌
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魏氏梭菌D型
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√
枸椽酸杆菌
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大肠杆菌
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√
√
√
假性结核杆菌
√
李司忒杆菌
√
√
巴氏杆菌
√
√
√
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√
√
支气管败血性鲍特氏菌
√
√
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√
肺炎雷伯克氏菌
√
肺炎双球菌
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鼠棒状杆菌
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泰泽氏杆菌
√
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结核杆菌
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钩端螺旋体
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念珠状链球菌
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溶血性链球菌
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金黄色葡萄球菌
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病
毒
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淋巴细胞性脉络丛脑膜炎
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鼠肝炎
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鼠肺炎
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呼肠弧Ⅲ
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仙台病毒
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仔鼠流行性腹泻
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小鼠脊髓灰质炎
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脱脚病
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K病毒
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鼠细小病毒
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胸腺病毒
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多瘤病毒
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啮齿动物腺病毒
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啮齿动物巨动物病毒
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如前所述，目前国际上对小鼠微生物监测内容尚无统一标准，各国亦常有变动现象，随着科学研究的发展，必然发现新问题，增添新内容，仅就不完全的资料，按表6-6统计，微生物监测内容，计细菌种，病毒种。结合我国实际，卫生部上海生物制品研究所制定的小鼠微生物和寄生虫质量监测标准可见表，他们主要着眼于“根据对小鼠群有危害的病原体及对动物实验研究有干扰的微生物、寄生虫”为原则，结合他们的具体条件，参照国外有关资料，似订的暂定标准，由浅入深，逐步提高，以达到目前国际上若干国家所订内容。
表实验小鼠微生物和寄生虫质量监测暂定标准(1983)
动物等级
一
悉生、无菌
二
SPF
三
清洁
四
普通
项 目
沙门氏菌
悉生小鼠
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结核分枝杆菌
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假结核耶尔森氏菌
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鼠肝炎病毒
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亲肺巴斯德氏菌
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支气管败血性鲍特氏菌
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胸炎克雷伯氏菌
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Tyzzer′s病原体
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单核细胞增多性李斯德氏菌
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金黄色葡萄球菌
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体外寄生虫
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涤虫
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绿脓假单胞菌
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枸椽酸杆菌
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大肠埃希氏菌O115aCK(B)
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线虫
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“√”表示应排除项目
上海市卫生系统实验动物微生物等级初步试行标准(讨论稿)可参看表6-8
上海卫生系统实验动物微生物等级初步试行标准(1985)
动物级别
应排除病原
小鼠
大鼠
地鼠
家兔
豚鼠
无特定病原体动物
清洁动物
普通动物
肠炎杆菌
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鼠伤寒杆菌
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体外寄生虫
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发癣菌
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淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒
流行性出血热病毒
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脱脚病病毒
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出血败血性巴氏杆菌
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鼠棒状杆菌
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支气管败血波氏杆菌
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肠道寄生虫
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泰泽氏病
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仙台病毒
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鼠肝炎病毒
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呼肠弧Ⅲ病毒
嗜肺巴氏杆菌
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绿脓杆菌
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链球菌(A群)
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各型肺炎球
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肺支原体
金黄色葡萄球菌(裸鼠)
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三、无特定病原体动物的用途
SPF动物由于排除了传染病和寄生虫，因此实验结果准确可靠，在生物医学各个领域的研究中得到了广泛的应用和肯定，SPF动物和普通动物在实验中的使用优点和医学科学各研究领域应用不同类型动物的选择可参见表6-3和表6-4。
通常的动物群中有许多病原体是隐性感染，在一般条件下，微生物与宿主间能保持相对平衡，动物不显现症状。一旦条件变化或动物在承受实验处理的影响下，这种平衡遭到破坏，隐性感染被激发，动物出现疾病的症状，这将严重地干扰实验的结果。尤其在非短期的实验中，这种现象(包括动物的死亡)在时间上、经济上以及实验的准确性方面，将带来巨大的损失。SPF动物就不会有这种现象，因此，近十几年来，SPF动物已成为标准的实验动物，其使用量不断增加，并有逐步取代普通动物的趋势。
绿脓杆菌的自然界中广泛存在，通常对动物不致病，对大鼠和小鼠的繁殖也没有影响，但用污染本菌的动物进行放射性照射试验时，却能诱发动物致死性的败血症。污染大肠杆菌、变形菌、葡萄球菌或某些极普通细菌的动物，经照射、实验性烧伤或可的松处理，也能出现这种现象。消化道寄生虫，除大量寄生虫外，对宿主常无严重影响，但在放射性照射试验中，消化道寄生虫所致的损伤部位，发生弥漫性出血感染，致使动物死亡。因此SPF动物在放射、烧伤等研究中比普通动物有稳定的应用价值。
SPF动物体内尚带有一些非病原性微生物，带菌情况不如悉生动物那样清楚明瞭，但它可以较安全、可靠地排除用普通动物作实验研究时所带病原体的干扰。
四、无特定病原体动物的培育
1.必须饲养在屏障系统内：培育SPF动物的目的的是为实验提供没有传染病的健康动物，因此SPF动物应饲养于屏障系统(密封的饲养室或超净饲养架)内，实行严格的微生物。应定期、按规定的监测内容和方法来检查有无致病菌(即特定的病原体)的污染。污染的动物依不同情况应降低等级或全部淘汰。一旦发生污染应彻底调查污染的原因。在被污染的屏障系统中工作的人员，往往附有与动物污染的同样微生物，应引起注意。
由于SPF环境中没有致病微生物，所以SPF动物的生产效果比普通动物为好，饲养中一般损失小。但屏障内一旦遭到污染，病原体的传播却更强烈。所以保持屏障系统的完好是非常重要的。
2.必须严格选择原种：SPF动物群的建立，其原种必须来源于无菌动物或悉生动物才能保证。即将悉生动物或无菌动物饲养于屏障系统的饲养室中，使之自然感染特定病原体以外的一般微生物，但应严格防范病原体的污染，并需要定期检查。
当然培育SPF动物，是以卵或子宫内无病原体为前提的。某些病原体可以垂直感染给胎儿，这个问题在培养SPF动物时应充分考虑。即应当严格选择剖腹产母体，该动物应未感染上述病原体，最好通过几代连续剖腹，来培育原种无菌动物，作为培育SPF动物的原种。
3.必须严格掌握SPF的质量标准：SPF动物必须首先排除各种人畜共患的传染病病原体，还应排除影响该种动物生产和实验使用上产生干扰的病原体。SPF动物质量监测标准应参照表6-7执行。当然我们不必完全照抄外国监测标准的内容，在培育SPF动物中，可根据我国具体情况，注意轻重缓急，先排除危害较大的病原体。上海生物制品研究所在这方面有下面几点经验体会。
⑴小鼠的淋巴细胞性脉络膜丛脑膜炎感染问题。虽然本病毒可通过胎盘传递，对人也有一定影响，是应该列入监测内容的，但其感染率极低，似可暂缓进行，宜先着重于呼肠弧类病毒或腺病毒的监测。
⑵有些病毒性病种，如有瘤病毒、胸腺病毒等，国内也未见有关报导，甚至可能国内尚难获得标准毒株，似宜在今后调查研究的基础上，考虑是否有必要列入我们监测标准的内容中。
⑶细菌性疾病中如结核病、李司忒菌病等仅是地区性的或特殊品系的偶发病种，亦不是当前我们需要监测的内容。
⑷我国近来自国外引进鼠种日益增多，可能会发生一些外来疫源。众所周知，自然疫源与地理区域有很大关系。国外引进的鼠种，来自日本的也不少，日本与我国相邻，地理条件较接近，如在欧洲国家中没有列入监测内容的大肠杆菌O115及枸椽酸杆菌，日本学者却很重视这些细菌，并列为监测内容，它又是小鼠易患的肠道传染病之一。在这方面我们应引起足够重视，即要探索自己的鼠群是否存这些病原，同时又要对外来鼠种加以监测。
⑸带有绿脓杆菌的小鼠，一般来说不影响它的生长发育和繁殖性能，亦不出现症状，但使用于抑制免疫机能实验时，可出现菌血症而发病，甚至死亡。该菌广泛存在于自然界，且具固有的抗药性，是较难在鼠群中排除的一种细菌。鼠群中是否存在绿脓杆菌，亦可间接反映管理SPF小鼠水平的一个侧面，所以亦宜列入监测质量内容中。
⑹霉形体种属繁多，在啮齿类动物中，小鼠的自然感染率远较豚鼠、家兔危害性小，但可引起多种症状，特别是侵犯鼠关节炎的霉形体，如伴随继发感染，易与鼠痘症状混淆，因此，亦应注意监测。
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第七章 野生动物在生物医学研究中的应用
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