《动脉粥样硬化》第一节　受体与标记配体的结合分析

第一节　受体与标记配体的结合分析

直接荧光法测LDL-R操作步骤/

     为了体外研究脂蛋白的细胞代谢和脂蛋白受体活性，早在1974年Goldstein和Brown就建立了成纤维细胞¹²⁵I标记LDL的配体-受体结合分析法。其基本原理是：用放射性同位素(常用¹²⁵I)标记LDL后，与细胞(通常为培养的单层成纤维细胞)、组织或含有LDL-R的制剂一起孵育，使LDL-R与¹²⁵I-LDL充分结合，形成受体-配体复合物，再除去未结合的¹²⁵I-LDL，测定结合沉淀物中的放射性。同时检测细胞、组织或受体制剂的蛋白质含量，即可计算出与¹²⁵I-LDL结合的LDL-R量。本法由于使用同位素，采样困难和操作过程繁琐，且费时、昂贵，故在临床诊断上难以广泛开展。

    Teupser等于1996年建立了直接荧光法检测LDL-R，他们采用1，1’二(十八烷基)-3，3'，3'，3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐(1,1'-dioctadecy1-3,3,3'，3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI)标记LDL，原理与同位素标记LDL相同。其操作步骤见图20-1。直接荧光法可定量检测附着的或非附着的各种类型的培养细胞(如正常人或FH病人的皮肤成纤维细胞、淋巴细胞、人U-937和鼠P388D1巨噬细胞系)的LDL-R和清道夫受体，其特点是特异性强，灵敏度高，不使用有机溶剂、不需预先进行脂质抽提，并省去了多步抽提步骤。正常人平均最大结合浓度为10.3±1.1μg/mg细胞蛋白，FH杂合子为5.2±0.8μg/mg细胞蛋白，FH纯合子0.9±0.2μg/mg细胞蛋白。

    图20-1 直接荧光法测LDL-R操作步骤

    亦有用胶体金标记LDL的，但是在受体-配体结合分析法中，正常人与FH患者的测定值有较明显的交叉现象，且操作比较繁琐。

    1987年Roach等比较了在硝化纤维素上用¹²⁵I-LDL、生物素-LDL、生物素-LDL、胶体金-LDL和胶体金-LDL结合银染四种方法检测LDL-R，发现胶体金-LDL结合银染的方法最为敏感，且安全、简单、快速、便宜。比较结果见表20-1。

    表20-1 硝化纤维上检测LDL-R的几种方法比较

    因素

    ¹²⁵I-LDL

    生物素-LDL

    胶体金-LDL

    胶体金-LDL加银染

    时间

    12～24h

    3h

    5～10min

    20min

    敏感性

    1.6fmoles

    1.6fmoles

    1.6fmoles

    193amoles

    线性范围

    0.5～15μg

    0.5～4μg

    0.5～4μg

    0.06～2μg

百拇医药网 http://book.100md.com/tcm/dongmaizhouyangyinghua/22_01.htm

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