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| 《现代检验检疫技术》 |
| 作者:朱水芳 主编 |
| 出版社：科学出版社 |
出版日期：2012/1/1 |
| ISBN：9787030332875 |
定价： 75.00元 |
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内容推荐
本书共十二章，主要介绍检验检疫领域最近几年开始应用的一些检验检疫技术、仪器及检验检疫实验室的要求等。在检测技术方面包括PCR、实时荧光PCR、基因芯片、微生物基因组测序DNA条形码及DNA指纹图谱技术、远程鉴定技术、纳米生物技术及流式荧光技术等的发展历史、基本原理及在本领域中应用的具体实例；仪器方面主要介绍检验检疫中常用的原子力显微镜、激光扫描共聚焦显微镜等仪器的基本原理、操作及在本领域中的应用。本书还介绍了在出入境口岸检验检疫实验室中所涉及的生物安全法规和计量标准、量值传递和溯源技术。
本书是从事检验检疫工作的一线人员、科技人员及高等院校相关专业研究生必备的参考书。
目录
前言
第一章 PCR技术
第一节 多重PCR技术
第二节 实时荧光PCR技术
第三节 肽核酸杂交诱捕PCR技术
第四节 其他PCR技术
参考文献
第二章 基因芯片技术
第一节 技术起源
第二节 基本原理
第三节 分类
第四节 应用范围
第五节 技术优缺点
第六节 基本操作步骤
第七节 应用举例
参考文献
第三章 原子力显微镜技术的生物学应用
第一节 技术起源
第二节 基本原理
第三节 主要方法
第四节 应用范围
第五节 技术优缺点
第六节 生物学应用注意事项
第七节 应用举例
参考文献
第四章 激光扫描共聚焦显微镜技术
第一节 概述
第二节 原理、结构及功能
第三节 荧光探针的选择
第四节 荧光探针的标记和影响因素
第五节 实验中存在的问题
第六节 主要仪器介绍
第七节 生物学研究中的应用
第八节 基本操作步骤
参考文献
第五章 有害生物远程鉴定技术
第一节 远程鉴定技术的发展
第二节 远程鉴定技术在检验检疫中的应用
第三节 远程鉴定技术展望
参考文献
第六章 微生物基因组学
第一节 概述._
第二节 微生物基因组测序
第三节 微生物基因组数据的分析
参考文献
第七章 DNA条形码
第一节 DNA条形码的起源与发展
第二节 DNA条形码的意义
第三节 DNA条形码的原理与操作
第四节 DNA条形码的应用
第五节 植物条形码基因
第六节 有关DNA条形码的争议
第七节 DNA条形码展望
参考文献
第八章 DNA指纹图谱技术
第一节 DNA指纹图谱技术起源与发展
第二节 DNA指纹图谱技术原理与应用
第三节 DNA指纹图谱技术的优势与劣势
参考文献
第九章 纳米技术与病原菌检测
第一节 纳米材料的特性
第二节 纳米粒子的制备
第三节 生物学常用纳米粒子及表征
第四节 核壳荧光纳米粒子
第五节 量子点
第六节 纳米金及其应用
第七节 磁性高分子微球
参考文献
第十章 流式荧光技术及应用
第一节 发展史概述
第二节 流式荧光技术的发展简史
第三节 流式荧光技术的原理
第四节 检测仪器的工作原理
第五节 流式荧光技术的特点
第六节 流式荧光技术的应用
第七节 展望
参考文献
第十一章 生物计量与基标准
第一节 生物计量概述与起源
第二节 生物计量特点
第三节 生物计量的任务
第四节 生物计量基标准
第五节 生物计量和基标准应用实例
参考文献
第十二章 实验室生物安全
第一节 生物安全的概念
第二节 加强实验室生物安全的重要性
第三节 我国的生物安全规范
第四节 病原微生物危险度评估
第五节 病原微生物实验室生物安全要求
第六节 动物实验室的生物安全
第七节 转基因实验室生物安全要点
第八节 实验室区域设置原则
参考文献
附录
图版
在线试读部分章节
第一章PCR技术
聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)是一种体外酶促基因扩增技术。
该项技术于1985年由美国的Mullis等首创，并由美国Cetus公司开发。
DNA在细胞中的复制是一个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA聚合
酶、DNA连接酶、DNA模板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH以及解开DNA的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。
PCR过程中进行的DNA复制反应，类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖
于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR过程由变性、退火、延伸三个基本反应步
骤构成。①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，模板双链
DNA或经PCR扩增形成的双链DNA解离成为单链，以便与引物结合；②模板DNA
与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与
模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板引物结合物在Taq
DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，以靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留
复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性退火延
伸过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4min，2～3h即可将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。到达平
台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩
增量可用Y＝(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩
增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均扩增
效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物
的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出
现“停滞效应”，这个时期称为平台期。PCR扩增效率与DNA聚合酶的种类和活性以
及非特异性产物的竞争等因素有关。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段和长产物片段
是由于引物所结合的模板不一样而形成的。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链
5′端之间，是需要扩增的特定片段。以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两
条互补的DNA为模板，引物是从3′端开始延伸，其5′端是固定的，3′端则没有固定的
止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的
5′端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3′端被固定了止点，保证了新片段的起
点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出
“短产物片段”按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽
略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯的DNA片段供分析
与检测。
该技术自发明以来，因其高灵敏度、高效率、高特异性的特点已经成为当前生命科
学研究与相关领域中的重要方法。该技术经过不断完善，目前已经发展出了一系列相关
技术，如多重PCR、实时荧光PCR、诱捕PCR(captured-PCR，C-PCR)等，这几种
PCR技术已经渗透到生命科学的各个领域，本章将详细介绍这几种PCR技术的基本原
理、技术方法、主要优缺点及应用范围等。
第一节多重PCR技术
一、基本原理
多重PCR(multiplexPCR)又称多重引物PCR或复合PCR，是在普通PCR的基
础上加以改进产生的。其原理与常规PCR基本相同，只是在一个PCR反应体系中加入
两对以上引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR
技术。该技术自1988年Chamberlain首次应用于杜氏营养不良症(Duchennemuscu-
lardystrophy)基因外显子缺失检测以来，由于能同时扩增多个目的基因，具有节省时
间、低成本、高效率，特别是节省珍贵实验样品的优点，所以一经提出即得到众多研究
者的青睐，并且发展迅速，已经成为生命科学各个领域里的一项成熟而重要的研究
手段。
二、技术方法
随着分子生物学的迅速发展，结合不断涌现的新技术，多重PCR开发出更多更广
泛的应用。例如，双寡聚核苷酸引物(dualprimingoligonucleotide，DPO)多重PCR
技术、多重PCR生物芯片技术、AFLP多重PCR、多重逆转录PCR、实时多重PCR
技术、荧光定量多重PCR等，以适应多种不同研究与应用的需要。其中最近发展起来
的DPO多重PCR技术具有广泛的应用前景，它克服了传统多重PCR的一些缺点，增
加了反应的特异性，简化了操作步骤。后面将详细介绍DPO多重PCR技术的原理、特
征及其应用。
三、多重PCR技术在生命科学研究中的应用
(一)检验检疫领域的研究与应用
1.病毒的检测与诊断
病毒因其繁殖力强、侵染性高、易变异等特点，极易造成病毒病的大流行，因此实
现快速灵敏的分析鉴定，是控制病毒病的首要选择。传统的病毒检测方法，如传统的生
物学方法、免疫学方法等，其最大的缺点就是周期长、灵敏度低。而多重PCR灵敏快
捷，适于大规模检测，能同时进行多种病毒的鉴定，对于病毒病的检测与预防，尤其是
在检测受到多种病毒复合感染的样品时，具有不可替代的作用。现已证实，多重PCR
(或多重RT-PCR)是病毒检测和诊断的强有力工具。可以通过选择不同的引物来区分
同一种病毒的不同株系，或者使用在特定位置含有不同核苷酸的引物来确定不同属。也
可以通过扩增存在株系差异的限制性内切核酸酶切割位点区段来区别不同的株系。国际
上，有关多重RT-PCR的报道很多，如Nie和Singh等利用多重RT-PCR方法鉴定了
PVY的不同株系。目前，国内也有很多关于多重RT-PCR应用的报道，如王中康等利
用多重RT-PCR方法同时检测出5种(马铃薯A病毒PVA、马铃薯S病毒PVS、马铃
薯X病毒PVX、马铃薯Y病毒PVY和马铃薯卷叶病毒PLRV)侵染马铃薯的病毒。
2.病原细菌的检测与鉴定
在同一PCR反应管中加入多种病原细菌的特异性引物进行多重PCR扩增，可实现
快速检测和分析多种病原细菌的目的。目前大多数病原细菌对人感染剂量很低，1～
10cfu的菌体细胞就足以使人致病。Ramesh等通过改良DNA提取方法，采用多重
PCR技术检测牛奶中的金黄色葡萄球菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌，敏感性为104cfu/
mL。Li等建立的多重PCR方法同时检测沙门氏菌和单核增生李斯特菌的敏感性为
103cfu/mL，但需要对PCR产物进行杂交鉴定。志贺菌、沙门氏菌和大肠杆菌均是属
于肠杆菌科的病原细菌，其形态和生化特性十分相似，容易交叉污染，共同导致食物中
毒。Vantarakis等调查发现90%的蚌类海产品都易同时感染沙门氏菌和志贺菌，他们
使用多重PCR扩增，增菌后可同时检测到10～100cfu/mL的沙门氏菌和志贺菌。肉制
品中常易同时感染大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌和志贺菌，Li等应用多重PCR方法
对肉制品中的这三种病原菌进行检测，结果显示其敏感性在牛肉、鸡肉中可达到
0.2cfu/g，在猪肉中达到1.2cfu/g。此外，将多重PCR与其他技术相结合在多种病原
细菌的同时检测中也有不少应用，如Morin等根据大肠杆菌O157∶H7编码脂多糖
(lipopolysaccharide，LPS)的rfbE基因，编码鞭毛抗原的fliC基因，霍乱弧菌O1编
码LPS的rfbE基因，伤寒沙门菌编码LPS的tyv基因设计引物，建立了反转录多重
PCR方法，能同时检测到此三种病原细菌。
3.病原真菌的检测及鉴定
病原真菌种类繁多且致病力强，对其的早期准确检测及鉴定是控制病情、减小危害
的重要措施。传统检测采用鉴别培养基或免疫学方法，样品需纯化，费时又费力；PCR
技术能检出混杂样品中的微量DNA片段。秦文彦、程洁等根据黄曲霉毒素生化途径中
的关键调控基因aflR、omt-1和ver-1的序列以及真菌共有的5.8SrDNA的ITS(在
rDNA基因中，16SrDNA和23SrDNA基因间隔序列称为ITS)序列分别设计了
ApaF/ApaR、OmtF/OmtR、VerF/VerR及ITS1/ITS44对引物，研究建立了产黄曲
霉毒素真菌及其潜在饲料或食品污染的多重PCR快速灵敏检测体系。董秀丽、赵斌为
了快速、准确又经济地鉴定植物根内与根际的菌根真菌区系，设计和应用了多重PCR
技术，对4种孢子HAUO3、Glomusintraradices、Scutellosporacastaneae和Glomus
sp.HAUO4的研究结果表明，嵌套多重PCR反应灵敏度高、特异性强，准确率可达
到95%。
4.线虫的检测及鉴定
病原线虫种类繁多，危害极其严重。且很多线虫幼虫形态非常相似，难以根据其特
征进行快速准确的种类鉴定。马以桂等根据剪股颖粒线虫、小麦粒线虫和维氏粒线虫的
rDNA-ITS区域序列，分别设计筛选了特异性引物AgrF1/AgrR1、TriF1/TriR1、WevF1/WevR1，构建了这3种线虫单条幼虫多重PCR检测体系，获得了3个大小差异
明显的片段，适合用于这3种线虫的快速准确检测。薄新文、李祥瑞根据捻转血毛线虫
β-微管蛋白基因组DAN序列设计了2对引物，建立了检测捻转血毛线虫苯并咪唑类药
物抗性的多重PCR方法，该方法灵敏性高，特异性强，具有很大的应用前景。
(二)医学领域的研究与应用
疾病的快速、准确的早期诊断具有十分重要的意义，快速特异灵敏的诊断是高水平
疗效的前提和保证。PCR技术一经建立，就迅速应用于各种临床疾病的诊断。如今多
重PCR已经成为这一领域的主力军，它结合传统经典的检测手段为疾病的快速灵敏特
异诊断和最佳治疗方案的确定展示了广阔的前景。
1.基因诊断
基因诊断当属世界医学研究攻关课题，它不仅是最权威的医学诊断方法，而且还是
医学基础研究中的高新手段。多重PCR技术因其高效、快速、诊断量大、实用性强的
特点，被竞相研究。在优生学上，基因诊断的意义非同寻常。脊椎肌肉萎缩是常染色体
上SMN1基因纯合缺失所引起的一种隐性遗传病，表型正常的基因携带者夫妇所育后
代的患病概率高达25%，因此产前诊断十分重要。Malcov等建立了多重巢式PCR检测
体系，对17周孕龄的孕妇进行羊水细胞检测，能同时扩增检测SMN1基因的外显子
exon7和exon8，实现了产前准确诊断。基因诊断的另一个重要应用领域是法医学。多
重PCR技术可以用于个体鉴定与亲子鉴定。线粒体基因组上广泛存在单核苷酸多态性
(singlenucleotidepolymorphism，SNP)，据此可以进行个体鉴定。Vallone等结合多重
PCR技术和毛细管电泳技术，通过设计特异性引物，可同时扩增11个特异区域，实现
了准确的个体鉴定。Schlenk等根据短串联重复序列(shorttandemrepeat，STR)位
点和性别特异位点，建立了同时扩增13个位点的多重PCR检测体系，所需模板DNA
用量可低至120pg，准确率高达99.99%。此项技术已经十分成熟，德国Serac公司开
发出的诊断试剂盒已经面市。在遗传性耳聋诊断、Y染色体微缺失分析等方面，多重
PCR也已成为一个重要的分子诊断方法。
2.肿瘤的诊断与研究
多重PCR技术一经诞生就成为癌症诊断和研究的重要手段。血管为肿瘤细胞提供
养分和氧气，清除废物，血管的形成在肿瘤细胞的增殖与转移中十分关键。血管内皮生
长因子VEGF广泛存在于众多肿瘤组织中。采用多重反转录PCR已经鉴定出VEGFA、VEGFB、VEGFC和VEGFD4种血管内皮生长因子，证实在病变的甲状腺组织中它们
均有表达。此外，多重PCR广泛应用于视网膜母细胞瘤基因杂合性突变的检测、细胞
黏附因子的表达研究等诸多方面，对于肿瘤的早期诊断、肿瘤的发展与治疗有着十分重
要的意义。
(三)遗传学领域的研究与应用
况少青等建立了一种以TaqStartTM抗体为TaqDNA聚合酶保护剂的扩增多个微卫
星位点的多重PCR方法，该方法产量高、成本低，适用于人类基因组计划，尤其是基
因作图、基因定位及人类进化等研究。扩增多个微卫星位点的多重PCR不仅在人类遗
传学研究中发挥重要作用，而且在其他动物，如小鼠、鸡、猪的遗传学研究方面也是一
种主要的研究手段，它为群体遗传学、医学遗传学、法医学及人类进化等研究提供了广
阔的应用前景。研究不同民族之间基因座差异对于基因诊断与基因治疗具有重要意义。
邹浪萍等采用多重PCR对我国汉族的CSF1PO、TPOX和TH01基因座进行等位基因
频率调查。该技术可简捷地从同一DNA样品中迅速获得较多的基因座数据，是多态性
研究的最佳方法。作为一种新的遗传标志――短的串联重复序列(STR)，也称微卫星
(microsatellite)，是以1～6个碱基对作为核心单位，串联重复排列而成的一类DNA序
列，在人类基因组中分布广泛，高度多态，并且呈孟德尔共显性遗传，因而用于构建高
分辨率的遗传连锁图以及复杂性相关基因定位等研究。在复杂性状的遗传研究中，常用
的策略是对具有同种表型特征的不同人群进行常见微卫星位点的基因分型和连锁分析。
四、多重PCR技术的优缺点
1.多重PCR技术的优点
多重PCR技术的优点表现在以下三个方面。
(1)高效性。在同一反应中同时检出多种病原物或对多个目的基因进行扩增分析。
(2)系统性。多重PCR很适宜对症状相同的一组病原物进行分析。
(3)经济简便性。多种病原物在同一反应管中同时检出，将大大节省检测时间和
试剂。
2.多重PCR技术的缺点
任何技术都不是完美无瑕的，多重PCR技术也不例外，也存在一定的弊端。
(1)引物设计过程复杂，要求引物自身或者引物之间尽量避免形成发夹结构或者二
聚体，并保证各引物有相近的退火温度。
(2)操作过程中需要对大量的引物进行筛选，对其影响因素及条件进行优化。
(3)容易出现扩增效率不高和假阳性现象。
五、多重PCR技术的影响因素和条件优化
自然界的每一物种都有其完全不同于其他物种的高度保守的核酸(DNA和RNA)
序列。理论上根据这些保守序列设计特异性引物，结合DNA聚合酶的高保真性，在多
重PCR反应体系中可扩增出数量不限的目的DNA片段。Tettelin等已成功进行了15
对引物的多重PCR。但是多重PCR反应体系与普通PCR相比更为复杂，实际操作中常
遇到扩增效率下降、非特异性扩增等许多问题，下面将影响多重PCR反应的主要因素
分叙如下。
(一)核酸模板
用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要
进行反转录生成cDNA，然后再进行普通的PCR扩增。核酸模板来源广泛，可以从动
植物细胞、培养的细胞、细菌、真菌、病毒、组织、病理样品、考古样品中提取。PCR
反应时加入的DNA模板量一般不高于几百纳克，太多的核酸会对扩增产生抑制作用，现在的技术水平已经能从单个细胞中制备出相应的cDNA文库。模板的量和纯度是影
响PCR实验结果的重要因素之一。模板量太少，会出现阴性结果或条带很弱；模板量
太多，则会出现条带弥散，模糊不清。合适的DNA模板量，可以减少因PCR多次循
环带来的碱基错配。模板纯度低或被降解会导致扩增不整齐。提高模板的纯度可以提高
扩增速率，减少非特异性扩增。
(二)引 物
加入多重PCR体系中的每对引物都应当满足单引物对PCR体系的引物设计原则，这些原则包括以下几个。
(1)引物的长度。引物过短会影响PCR的特异性，要求有13～30bp，以保证特异
性结合；引物过长使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度(74℃)，也会影响产
物的特异性。
(2)G+C含量一般为40%～60%。
(3)4种碱基随机分布，避免有连续3个以上的相同嘌呤或嘧啶存在。
(4)避免引物自身或引物之间形成4个或4个以上的连续配对。
(5)引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70%或者有连续8个互补碱基同源，否则会导致非特异性扩增。
(6)引物的3′端避免使用碱基A，并且避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。
(7)为避免污染的基因组DNA的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
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