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| 《中西医结合科研实验方法学导读》 |
| 作者:陈文列 等主编 |
| 出版社：科学出版社 |
出版日期：2011/4/1 |
| ISBN：9787030304513 |
定价： 36.00元 |
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内容推荐
陈文列、吴锦忠主编的《中西医结合科研实验方法学导读》是《全国高等院校中西医临床医学专业规划教材》之一，共分为四篇，第一篇介绍组织显微结构与细胞超微结构研究方法(含光镜、电镜、激光扫描共聚焦显微镜实验方法与结构观察)，第二篇介绍细胞生物学实验研究方法(细胞培养、免疫细胞分析、血液流变学、流式细胞术)，第三篇介绍生化与分子生物学实验研究方法(核酸分析、PCR、分子杂交与克隆、蛋白表达与提取分析等)，第四篇介绍中药与天然药物化学及其活性研究方法(化学成分指纹图谱、活性物质筛选等)。本书重点介绍实验方法、技术(经典、常用或新技术)的理论与操作，具有新颖性、实用性、系统性、可操作性强的特点。
《中西医结合科研实验方法学导读》可作为中西医结合专业硕士和博士研究生教学用书，以及从事中西医结合基础、临床应用基础及中医药现代化基础研究者的通用科研实验指导书。
目录
总前言
第一篇组织显微结构与细胞超微结构研究方法
第一章组织显微结构研究的光镜实验方法
第一节组织学和病理学常规实验方法
第二节光镜组织化学与特殊染色
第三节光镜酶组织化学
第四节光镜免疫组织化学
第五节光镜原位杂交组织化学
第六节原位凋亡检测技术(TUNEL法)
第七节光镜显微镜图像定量分析
第二章细胞超微结构研究的电镜实验方法
第一节概述
第二节透射电镜常规样品制备
第三节示踪与离子电镜细胞化学
第四节电镜特殊染色
第五节电镜免疫细胞化学
第六节细胞器标志酶电镜细胞化学
第七节透射电镜、扫描电镜与超微结构图像定量分析
第三章细胞超微结构与组织显微结构的观察
第一节概述
第二节细胞超微结构与常见变化
第三节几类细胞的超微结构
第四节组织显微结构与常见病变
第四章常见器官的组织显微结构与细胞超微结构及病变
第一节消化器官的显微结构与超微结构及病变
第二节运动器官的显微结构与超微结构及病变
第三节心血管的显微结构与超微结构及病变
第四节内分泌器官和组织的显微结构与超微结构及病变
第五节神经系统的显微结构与超微结构及病变
第六节泌尿器官的显微结构与超微结构及病变
第七节免疫器官的显微结构与超微结构及病变
第八节呼吸器官的显微结构与超微结构及病变
第九节血细胞的显微结构与超微结构及病变
第五章组织和细胞立体结构与成分研究的激光扫描共聚焦显微术
第一节概述
第二节荧光探针的选择和荧光标记样品的制备
第三节组织和细胞结构与成分观察实验
第四节细胞器三维结构观察实验
第五节细胞生理功能动态观察实验
第六节激光扫描共聚焦显微镜
第二篇细胞生物学实验研究方法
第六章细胞培养与分析
第一节细胞培养的基本原理与技术
第二节细胞培养的方法
第三节细胞的冻存、复苏与运输
第四节体外培养细胞的观察
第五节细胞增殖、凋亡分析
第七章免疫细胞的分离与分析
第一节概述
第二节免疫细胞的分离制备
第三节免疫细胞的功能分析
第八章血液流变学研究技术
第一节概述
第二节血液黏度检测
第三节血小板聚集、黏附功能检测
第九章流式细胞术
第一节概述
第二节单细胞悬液的样本制备
第三节流式细胞术的标记方法、结果分析与意义
第四节流式细胞术在医学科学研究中的应用
第五节流式细胞仪结构和原理
第三篇生化与分子生物学实验研究方法
第十章核酸提取分析
第一节概述
第二节DNA提取
第三节RNA提取
第四节核酸分析
第五节核酸电泳
第十一章分子杂交
第一节概述
第二节Southern印迹杂交
第三节Northern印迹杂交
第四节Western印迹杂交
第十二章聚合酶链反应(PCR)
第一节概述
第二节PCR技术基本操作
第三节RT—PCR
第四节PCR引物设计
第十三章分子克隆
第一节概述
第二节目的DNA片段的获取
第三节目的DNA片段的处理、纯化及鉴定
第四节载体的选择与处理
第五节载体与目的基因片段的连接
第六节重组质粒转化感受态大肠埃希菌
第七节重组克隆子的筛选与鉴定
第十四章蛋白表达
第一节概述
第二节外源基因在大肠埃希菌中的诱导表达
第三节外源基因在真核细胞中的表达(细胞转染)
第十五章蛋白质的提取和分析
第一节概述
第二节蛋白的分离提取、纯化
第三节总蛋白含量测定
第四节酶联免疫分析
第五节放射免疫分析
第六节蛋白电泳
第十六章常规生物化学实验技术
第一节概述
第二节糖类实验分析
第三节酶类实验分析
第四节脂类实验分析
第四篇中药与天然药物化学及其活性研究方法
第十七章中药与天然药物化学成分的一般研究方法
第一节中药与天然药物化学成分提取
第二节中药与天然药物化学成分分离
第三节中药与天然药物化学成分的研究各论
第十八章中药与天然药物化学成分指纹图谱研究方法
第一节构建中药与天然药物化学成分指纹图谱的技术要求
第二节应用HPLC构建草珊瑚化学成分指纹图谱的研究实例
第十九章中药与天然药物活性物质筛选方法
第一节生物活性导向分离法筛选中药与天然药物活性物质
第二节计算机模拟技术筛选中药与天然药物活性物质
第三节中药与天然药物化学成分的生物活性测试法
第四节中药复方药效物质基础研究方法
彩图
在线试读部分章节
第一篇组织显微结构
与细胞超微结构研究方法
第一节组织学和病理学常规实验方法
一、概述
组织学和病理学实验方法在医学科学领域里占有重要地位，是医学教学和科研中不可缺少的一
个组成部分。组织制片标本可以显示各种组织细胞的基本结构和形态，而制片的质量将直接影响科
研教学观察和临床病理诊断。
最早应用的组织制片技术是冰冻切片，但冰冻切片显示的组织清晰度相对较差，目前通常用于
术中快速诊断，或者用于显示组织中的脂类物质、某些酶等。随着冰冻切片的应用和实践，人们进一
步利用石蜡的硬度，将要检查的组织块浸渍并包埋于这种坚硬的介质之中，制成了石蜡切片，石蜡切
片不仅清晰度高，而且易于保存，可用于大部分的染色和检验，是目前最常用的制片方法。后来又利
用明胶、火棉胶等物质的韧性来包埋组织，制成了明胶切片和火棉胶切片，用于较大、较坚硬、比较脆
弱的组织和易于塌陷的器官等的制作；用塑料包埋或树脂包埋制作不脱钙的骨组织切片等。目前石
蜡切片制作法仍是组织病理学的常规实验方法。
二、用途、原理、特点
1.主要用途
石蜡切片可通过常规染色在光镜下观察其一般的显微结构，亦可通过特殊染色技术、免疫组织
化学技术以及原位杂交等技术观察组织的特定结构成分。
2.实验原理
将细胞和组织进行固定，使其保存原有的形态和固有物质；通过包埋剂渗透凝固后制作成有一
定硬度的石蜡包埋块，再切成几微米厚的切片，经染色剂染色后可在光镜下观察其显微结构。
3.特点
常规石蜡切片清晰度高，易于保存，可用于大部分组织的染色和检验。
三、实验操作(石蜡切片法)
(一)简要步骤
简要步骤如下：①取材；②固定；③脱水；④透明；⑤浸蜡；⑥包埋；⑦切片；⑧染色；⑨封固。
(二)具体步骤
1.取材
(1)主要实验仪器/器材/重要试剂
1)仪器或器材：剪刀、镊子、单面刀片或双面刀片、标本瓶、标签等。
2)试剂：麻醉剂、生理盐水等。
(2)实验操作
1)预先准备好固定液(见固定章节)，分装在标本瓶内，贴好标签。
2)动物组织取材：将动物麻醉或处死，暴露所需的器官；用锋利的刀片切下所需器官或组织，进
行初步修切后，尽快投入固定液。
3)细胞取材：①涂片法。血液等可直接均匀涂在载玻片上，胸腔积液、腹水、尿液、脑脊液以及
悬浮的培养细胞等细胞浓度小的标本，应先用离心机以1500r/min离心10min，取沉淀涂片，干燥后
固定。②爬片法。贴壁细胞可直接培养在盖玻片上，固定后染色。③包埋法。离心后固定细胞团，或用琼脂预包埋细胞后，再行常规脱水，石蜡包埋。
(3)注意事项、出现问题与解决办法
1)取材刀具：取材刀具必须锋利。切取标本不应挤压和揉擦，不应使用有钩镊子或血管钳等手
术器械镊取标本，以免损害组织造成人为的组织变化。
2)取材时间：取材要及时，并及时固定，越新鲜越好。
3)取材顺序：根据死后组织结构改变的速度快慢而定。先腹腔后胸腔，先消化管后肝、脾等多
血的器官，然后是神经组织、骨和皮肤等。
4)取材部位及切面方向：组织块应包括各脏器的重要结构和主要病变部位，体积大和分叶的器
官视不同组织取多个部位。病理组织最好选取病变与正常组织交界处，以便对比；取材时应取最有
利于观察上述部位的切面方向。如肾脏组织应包括皮质、髓质和肾盂；长骨纵切可将其组织结构完
整展现；纤维组织、肌肉组织、胃肠道、气管等取材时尽可能按与纤维和肌肉平行走向切取为佳，避免
斜切或无规律切取。
5)取材大小及数量：组织块力求小而薄，一般标本，以不超过1.5cm×1.5cm×0.5cm为宜，体
积小的组织，如甲状腺和肾上腺可整体取材固定；用于免疫组化染色的组织块宜更小而薄；冰冻切片
组织块可略厚。较容易发脆的组织，如甲状腺、肝脏、血块、淋巴结、大块癌组织等可适当厚一些，而
脂肪组织、肺组织、纤维性肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应取薄一些。组织块的数
量依具体情况而定，一般以满足相关研究需要为准。
6)尽量保持组织的原有形态，防止其弯曲扭转。对神经、肌肉、皮肤等组织则可将其两端用线
扎在木片或硬纸片上固定。胃肠、胰腺等组织，应先平展于草纸上黏着以后，慢慢地放入固定液中。
标本上附着的软组织，如脂肪等，应在不影响观察的原则下，尽量剥去或切除。组织块上如有血液、黏液、污物等，应先用生理盐水冲洗，然后再投入固定液。
7)骨组织或组织内的钙化灶，应在固定之后进行脱钙，再行修切。
2.固定
(1)主要实验仪器/器材/重要试剂
1)10%缓冲甲醛固定液：甲醛100ml，蒸馏水900ml，NaH2PO4·H2O4g，Na2HPO4(无水)6.5g。
2)4%多聚甲醛固定液：多聚甲醛40g，蒸馏水600ml，加热，边加适量的NaOH慢慢溶解后，将
pH调至7.2～7.4，加入NaH2PO4·H2O4g，Na2HPO4(无水)6.5g，蒸馏水定容到1000ml。
(2)实验操作
1)组织放入固定液后，常温放置24～48h。
2)根据组织块大小，流水冲洗数小时后再进行后续操作。
(3)注意事项、出现问题与解决办法
1)组织固定越新鲜越好。
2)组织块不宜过大。
3)组织固定时间不宜太短，也不宜太长。
4)固定液的量要充分，固定液的量与组织的体积比应达到10∶1左右。
5)合理选择固定液。一般的标本都可以应用甲醛固定液来固定，但是甲醛对一些特殊物质固
定不好，如要显示糖原，要选择无水酒精或丙酮来固定组织；显示狂犬病毒的包含体，必须采用丙酮
来固定等。
6)甲醛固定后要充分冲洗，否则可能会对各种染色造成影响。
3.脱水、透明、浸蜡
(1)主要实验仪器/器材/重要试剂
1)脱水机或磨砂口的玻璃缸。
2)无水乙醇，95%乙醇，蒸馏水。将无水乙醇或95%乙醇与蒸馏水按比例配成70%、80%、90%浓度的乙醇溶液。
3)二甲苯。
4)熔点为52～54℃(软蜡)和58～60℃(硬蜡)的石蜡。
(2)实验操作
1)脱水：70%乙醇1～2h，80%乙醇1～2h，90%乙醇1～2h，95%乙醇1～2h，100%乙醇Ⅰ
0.5h，100%乙醇Ⅱ0.5h，100%乙醇Ⅲ1～2h。
2)透明：二甲苯Ⅰ30min，二甲苯Ⅱ1～2h。
3)浸蜡：石蜡加热到60～65℃使其处于熔解状态，软蜡0.5h，硬蜡Ⅰ0.5h，硬蜡Ⅱ1～2h。
(3)注意事项、出现问题与解决办法
1)乙醇脱水力强，但对组织有收缩、硬化和易脆的不良影响。因此，在使用时，通常是从低浓度
至高浓度；时间不宜太短，也不宜太长，应根据组织的大小和质地灵活调整。
2)二甲苯易致组织脆硬，因此，透明时间不宜过长，可随时观察，组织完全透明后即止。
3)乙醇和二甲苯易挥发，且经脱水、透明后浓度易发生改变，应及时更换。
4)蜡在高温下对组织和固有物质会有影响，因此浸蜡时间不宜太久。浸透后应立即包埋，如需
耽搁，应停止加热让其降温凝固，包埋时再加热溶解。
5)熔化石蜡必须在熔蜡箱内进行，不得用明火加温，且温度不得超过65℃。
6)熔蜡应及时过滤、更换。
4.包埋
(1)主要实验仪器/器材/重要试剂
包埋机、冷冻台、一次性包埋盒、包埋模具、镊子等。
(2)实验操作
1)打开包埋机，让石蜡预热至65℃左右；打开冷冻台预冷。
2)在包埋盒上标记好标本序号。
3)先将熔化的石蜡倾入包埋模具中，再用加热的镊子轻轻夹取已经过浸蜡的组织块，使组织块的
最大面或切面向下埋入熔蜡中；包埋于同一蜡块内的多块细小组织应靠近并尽量位于同一平面上。
4)盖上包埋盒，将包埋盒的背面凹槽用熔蜡填充。
5)待包埋模具内的熔蜡凝固后，将蜡块取出备用。
(3)注意事项、出现问题与解决办法
1)包埋时要认真核对组织块的标本号顺序。
2)必须严防各种异物污染，勿将无关组织埋入蜡块内。
3)包埋过程要操作迅速，以免组织块尚未埋妥前熔蜡凝固。
4)包埋块内避免气泡产生，可用加热的镊子去除。
5)包埋定向组织时要注意将切面朝下，管腔组织和皮肤等需立埋。
5.切片
(1)主要实验仪器/器材/重要试剂
包埋机、水浴锅、烘片机或烤箱、切片刀、毛笔、载玻片等。
(2)实验操作
1)将要进行切片的组织块固定于切片机标本架上，旋紧。
2)调整好样品面与切片刀在X/Y/Z轴的合适位置，调整好样品面与切片刀间距离。
3)修平切面，如果没有特定标志，原则上是暴露组织的最大切面。
4)根据需要设置切片厚度并进行切片(一般4～8μm)，用毛笔收集蜡带。
5)选择佳片放入恒温水浴锅内展平后裱片，使切片平整地贴附在载玻片上。
6)放入烘片机或烤箱内烘片3～5h，使切片牢牢黏附在载玻片上。
(3)注意事项、出现问题与解决办法
1)切片刀必须锋利，切片时刀口从一侧开始使用，用钝后按顺序挪动一个刀口，避免损伤的旧
刀口重复使用和浪费新刀口。
2)切片速度要均匀，以40～50次/min为宜。
3)切勿使毛笔触及刀刃，以免伤及刀口。
4)载玻片要清洗干净，以免影响切片黏附，必要时可用多聚赖氨酸等防脱处理。
5)裱片水温要适宜(40～45℃)、洁净，每切完一个蜡块后，必须认真清理水面，不得遗留其他的
组织碎片。如切片不易展开，可先放入30%乙醇中预展片，再放入温水中。
6)烘片温度和时间要适宜(60℃3～5h)，时间过长、温度过高易导致固有物质受影响，尤其在
免疫组化原位杂交时；温度低、时间短易导致切片黏附不牢而掉片。
6.H-E染色、封固
(1)主要实验仪器/器材/重要试剂
1)苏木素：Harris苏木素。苏木素2.5g，无水乙醇25ml，硫酸铝钾(钾明矾)50g，或硫酸铝铵
(铵明矾)，蒸馏水500ml，黄色氧化汞1.25g，冰醋酸20ml；配制溶液时，先将蒸馏水稍加温，加入苏
木素并不停搅拌直至完全溶解，继而加入硫酸铝钾，令其充分溶解后，加入柠檬酸和水合氯醛，继续
搅拌均匀，全部溶解后再加入碘酸钠，搅拌均匀，此时溶液的颜色变为深棕色，过滤后即可使用。
Ehrlich苏木素。苏木素1g，无水乙醇50ml，甘油50ml，硫酸铝钾7.5g，蒸馏水50ml，冰醋酸5ml；将
苏木素溶于无水乙醇里，硫酸铝钾溶于蒸馏水中，然后所有的试剂都加在一起，充分搅拌均匀后，放
于阳光充足的地方慢慢氧化成熟，大约4周才可使用。
2)0.5%伊红：伊红1g，70%～75%乙醇200ml；先将伊红用蒸馏水(少许)调成糨糊状，再加入乙
醇，边加边搅拌，直到彻底溶解，此时试剂有些混浊，加入少许冰醋酸，试剂逐渐转变为清亮，呈鲜红色。
3)1%盐酸乙醇：70%乙醇100ml，盐酸1ml。
4)染色缸，染色架，盖玻片，梯度乙醇，二甲苯，中性树胶。
(2)实验操作
1)二甲苯脱蜡(2缸)各10～15min。
2)梯度乙醇入水：无水乙醇，95%、90%、80%、70%乙醇，蒸馏水各5～10min。
3)Ehrlich苏木精液染色20～30min或Harris苏木素2～3min。
4)流水洗去苏木精液，1%盐酸乙醇1～3s，水洗，返蓝20～30min。
5)伊红液染色1～3min，快速水洗。
6)梯度乙醇脱水(与入水相反)，二甲苯透明2～3min，中性树胶封片。
(3)注意事项、出现问题与解决办法
1)Harris苏木素成熟快，染色快，但只能用3个月左右就慢慢失效；Ehrlich苏木精成熟慢，染色
久，但用它染后，细胞核染色清晰，不易过染，可长期使用，对于用酸脱钙组织细胞核的染色，该试剂
优于其他各种苏木素，可根据需要选择。
2)二甲苯脱蜡要彻底，时间为10～20min，试剂要及时更换，否则均影响染色。
3)苏木精液染色液每次染色前应过滤或用纸把液面的氧化膜去除，以免污染切片。
4)染色过程中所用的时间要根据染色时的室内温度、染液的新鲜程度等灵活掌握。
5)低浓度乙醇对伊红有分化作用，切片经低浓度乙醇脱水时间不宜久置。
6)苏木素过染用1%盐酸乙醇分色，伊红过染用低浓度乙醇分色；若染色太浅均可再染。
7)中性树胶用二甲苯稀释后再用，封片时避免产生气泡。
四、几种特殊组织切片技术
(一)骨组织脱钙切片制备
骨骼组织是一种坚硬的结缔组织，有机成分凝胶和无机成分骨盐两种成分紧密结合形成骨基
质，使其变得十分坚硬，不能直接制片。因此，需脱钙处理，使钙盐溶解，组织变软后才能制作石蜡切
片。脱钙后制作方法同软组织。在诸多脱钙方法中，EDTA脱钙法是一种较为理想的、可行的方法。
1.主要实验仪器/器材/重要试剂
10%EDTA脱钙液：EDTA10g，先用600～800ml蒸馏水将其溶解(需加适量NaOH助溶)，然后
加蒸馏水至1000ml，调pH至7.2～7.4。
2.实验操作
1)将1cm×0.5cm×0.3cm大小的骨组织浸泡在5～10倍的EDTA脱钙液中。
2)脱钙时间：一个月左右，具体视标本大小、室温而定。
3)效果判定：用大头针扎入脱钙后的骨组织，没有明显阻力，类似软组织即可。
3.注意事项、出现问题与解决办法
1)脱钙液要勤换，每2～3天更换新液一次，否则影响脱钙速度。
2)标本不可太大，可在脱钙过程中组织较软后二次修切，以加快脱钙速度。
3)震荡、加温和微波等可加快脱钙速度，但温度不可过高，否则影响组织的抗原性等。
(二)不脱钙骨组织切片
硬质切片也称不脱钙骨组织切片，因不脱钙而保持钙盐分布。以丙烯酸树脂(GMA)，TBBA环
氧树脂及甲酯甲基丙烯(MMA)等包埋，结合硬质切片机切片，用于骨组织形态学研究，如哈弗管、骨
小梁的观察。这里以MMA包埋为例。
1.主要实验仪器/器材/重要试剂
1)洗涤剂：称取氢氧化钠50g，氯化钠200g，加蒸馏水至1000ml溶解备用。
2)MMA准备：①洗涤：洗去MMA单体中的阻聚剂，将MMA与洗涤剂按2∶1体积比加入分液漏
斗，充分摇匀，静置分离，弃去下层，共2次；②用蒸馏水洗3次，方法同上；③吸水：无水氯化钙吸水
30min，过滤去水；④贮存：2～4℃保存。
3)过氧化苯甲酰(市售试剂含水)使用前作干燥处理，将试剂盛于玻璃平皿，置干燥器待水分吸
干备用。
4)MMAⅠ液配制：加速剂过氧化苯甲酰1.5g溶于100mlMMA。
5)MMAⅡ液配制：加速剂过氧化苯甲酰3.5g溶于100mlMMA。
6)各级乙醇，二甲苯。
2.实验操作
1)常规固定、乙醇脱水与二甲苯透明。
2)MMAⅠ液24h×2次。
3)MMAⅡ液24h×3次。
4)加入MMAⅡ液，抽真空30min，待气泡完全排出，盖上瓶盖，用密封纸封口，于室温下约7d时
间开始凝结，并逐渐变硬。
5)硬质切片机切片80μm，常规裱片，染色。
3.注意事项、出现问题与解决办法
1)包埋必须在彻底脱水和渗透之后进行。
2)包埋时温度不宜过高，以不超过40℃为宜。
3)市售MMA含有稳定剂防止固化，使用前需洗去稳定剂方可使用。
4)骨切片在染色时易脱片，因此载玻片应作防脱处理。
(三)冷冻切片的制作方法
冷冻切片是直接用新鲜组织冰冻后获得一定的硬度，然后进行切片制作，目前主要用于临床术
中快速诊断和脂溶性物质的检测，以及其他在组织常规石蜡切片制作过程中易受影响的物质的检
测，如一些酶类等。
1.主要实验仪器/器材/重要试剂
冷冻切片机，冷冻切片包埋剂，载玻片，固定液等。
2.实验操作
1)打开冷冻切片机预冷，降至所需温度；
2)取出组织支撑器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻。
3)将冷冻好的组织块，夹紧于切片机支撑器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
4)调好欲切的厚度，一般在5～10μm间。
5)调好防卷板至适当的位置。
6)切出切片后，取一载玻片，将其附贴上。
7)将切片放入固定液固定1min后即可染色。
3.注意事项和出现问题与解决办法
1)防卷板和切片刀应保持干净，不得有残余的包埋剂黏于刀或板上，否则会破坏甚至撕裂
切片。
2)组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。如果
使用未完全固定的组织作冰冻切片，就会出现冰晶，影响切片。
3)应视不同的组织性质选择不同的冷冻度。如：切脑组织、肝组织和淋巴结，在-15～-10℃
左右；切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-20～-15℃左右；切带脂肪的组织应调至-25℃左
右，组织含大量的脂肪时，应调至-30℃。
4)用于附贴切片的载玻片最好经防脱处理，以防掉片。载玻片不能存放于冷冻处，于室温存放
即可，否则切片不易黏附。
(黄云梅黄美雅)
第二节光镜组织化学与特殊染色
一、简介
特殊染色是常规染色(HE染色)的必要补充，也是染色技术中一个不可缺少的组成部分。HE
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